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本试剂盒以RNA为模板，反转录和qPCR在同一体系中连续进行。本试剂盒采用高质量的反转录酶和Taq DNA聚合酶，以及本公司研发的反应体系，大大提高了反应的扩增性能和特异性。反应过程中无需添加试剂，无需开盖，避免了污染。一步法RT-qPCR技术可用于RNA分子的检测和结构分析、cDNA克隆、RNA水平上的特定的基因表达分析等多种领域的应用。

• RNA样品要避免RNase污染。用于cDNA合成的器具须用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液37℃处理12h；然后在120℃高压灭菌30min去除残留的DEPC。
  
• 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌(180℃，60min)或者上述DEPC处理的器具盛装，使用的无菌水须用0.1% DEPC处理后进行高温高压灭菌。建议RNA实验使用的器具、试剂和无菌水专用。
  
• 当同时进行多次反应时，应将各种试剂配制成混合液然后分装到各个管中，以减少实验操作或实验之间的误差(整个反应过程应在冰浴条件下进行)。
  
• 本试剂盒不能使用Oligo(dT)或Random Primer合成第一链cDNA。
  
• 为了保证反应成功，请使用高质量的RNA模板。

• 将各组分溶解并分别混匀后，轻微短暂离心，然后冰浴放置。
  
• 在冰浴的PCR管中加入如下RT-PCR反应混合物：
  

  成分	用量
  2×One-Step RT-qPCR MasterMix	10μL
  正向引物(10μM)	0.4μL
  反向引物(10μM)	0.4μL
  RT enzyme Mix	0.65μL
  RNA Template	0.1～100ng
  RNase-free ddH2O	至20μL

• 在实时荧光定量PCR仪上按下列条件进行一步法反应程序：
  

  步骤	温度	持续时间	循环数
  反转录	50℃	5min	hold
  预变性	95℃	3min	hold
  变性	95℃	10s	40
  退火/延伸/采集荧光信号	60℃	30s
  熔解曲线	按照仪器要求设置