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本制品是一种即用型混合液，含有快速热启动Taq DNA酶、MgSO₄、dNTP Mix和一些稳定剂。提供的2×Master Mix含有除引物、模板和探针外的所有组分，用于快速探针法实时定量PCR。快速热启动Taq DNA酶和独有的缓冲系统，在实时qPCR过程中减少了引物二聚体的形成，增强了扩增产物的特异性和检测的灵敏度。

DNF Buffer专用于存在多个非特异性扩增位点的引物。对于一些没有很好引物的DNA序列，DNF Buffer可根据下列方法加入到反应体系中。

组分	1mL	5mL
2×TaqMan Fast qPCR预混液(高ROX)	1mL	5×1mL
DNF Buffer	200μL	1mL
Sterilized ddH2O	1mL	5×1mL

保存：-20℃，避免反复冻融。


适用于需要用高浓度ROX参考染料进行校正的实时PCR仪器，比如Applied Biosystems 5700，Applied Biosystems 7000，Applied Biosystems 7300，Applied Biosystems 7700，Applied Biosystems 7900，Applied Biosystems 7900HT，Applied Biosystems 7900 HT Fast，Applied Biosystems StepOne™和Applied Biosystems StepOnePlus™。

• 配制反应体系
  
  • 溶解并混匀各组分，并将各组分短暂离心；
    
  • 根据下表准备反应体系；
    

    成分	用量	终浓度
    2×TaqMan Fast qPCR预混液(高ROX)	10μL	1×
    10μM Forward Primer	0.4μL	200 nM
    10μM Reverse Primer	0.4μL	200 nM
    10μM probe	0.2～0.4μL	100～200 nM
    Template DNA	As required	＜250ng
    DNF Buffer(Optional)	2μL	0.5M
    PCR-grade water	至20μL	-

    
    注意：
    DNF Buffer只加入到引物存在多个非特异扩增位点的反应混合液中，普通引物勿加。
• 运行qPCR
  
  • 根据下列循环程序使用两步法运行qPCR：
    

    步骤	温度	持续时间	循环数
    预变性	94℃	3min	1
    变性	94℃	5s	40
    退火/延伸/数据采集	60℃	30s

  • 如果引物最适退火温度不在60～65℃左右，根据下列循环程序使用三步法运行qPCR：
    

    步骤	温度	持续时间	循环数
    预变性	94℃	3min	1
    变性	94℃	5s	40
    退火	最适退火温度	15s
    延伸/数据采集	72℃	30s

  
  
  常见问题指南：
  
  • 荧光强度低或无
    
    • 探针标记不上
      ① 重新合成探针
      
    • 无目的扩增产物
      ① 始终使用纯化过的高质量完整DNA作为模板；
      ② 琼脂糖凝胶电泳分析模板完整性；
      ③ 确保引物可用；
      ④ 循环程序缺乏必要步骤，检查循环程序。
      
    • 引物浓度过低
      ① 使用引物终浓度为0.1～0.5μM。
      
    • 光通道不适合探针
      ① 根据标记的探针选择正确的光通道。
  • 无模板的对照组出现阳性信号(NTC)
    
    • 污染
      ① 扔掉所有试剂，清洗所有移液枪及其表面，准备新鲜的引物贮备液等。
  • 荧光信号增加迟
    
    • 起始模板低
      ① 提高模板DNA的量。
      
    • 退火温度过高
      ① 利用梯度优化退火温度
      
    • 引物或探针浓度过低提高引物浓度。
      ① 200 nM探针浓度通常已经足够。
    
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