产品目录

本制品是一种非常方便的qPCR预混液，包括dNTPs、Hotstart Fast Taq polymerase、MgCl₂、荧光染料、参考染料和独特的的缓冲组分。本制品具有灵敏度高、信噪比高和特异性强等特点。

• 冰上溶解Green-Go qPCR Mix，模板DNA，引物和RNase-free水。彻底混匀各溶液组分。按下表配制反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×Green-Go Mastermix	10μL	1×
  Forward Primer(10μM)	0.2～0.4μL	100～200 nM
  Reverse Primer(10μM)	0.2～0.4μL	100～200 nM
  Template DNA	Variable	≤ 500ng/reaction
  RNase-Free ddH2O	至20μL	-

• 根据下列循环程序运行qPCR：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	3min	1
  变性	95℃	3sec	40
  退火/延伸/数据采集	60℃	20sec
  溶解曲线分析	按照仪器要求进行设置

• 无任何荧光信号
  

  可能原因	意见和建议
  循环程序设置错误。	检查仪器设置是否与实验相符。
  缺少组分(比如引物或模板)。	检查反应混合液的组成。
  循环程序缺少必要步骤	检查循环程序。
  反应管是空的，未加入相应试剂	离心后检测PCR板中的每一个孔

• 荧光信号增加较迟
  

  可能原因	意见和建议
  循环程序设置错误。	检查仪器设置是否与实验相符。
  起始模板不足。	检查模板浓度的计算；如果有可能则提高模板浓度。
  退火温度过高。	利用梯度优化退火温度；如果梯度特征不明显，则退火温度按每2℃为一个梯度进行递减。
  扩增片段长导致延伸时间不足。	增加延伸时间。
  引物浓度过低。	提高引物浓度(每个引物最高为900 nM)。
  PCR程序不合适。	确保使用的是推荐的PCR程序。如有需要，以推荐的程序为出发点进行优化。

• 荧光信号正常但效率低
  

  可能原因	意见和建议
  吸量误差	检查反应混合液的组成。
  前面反应形成的引物二聚体污染了体系。	PCR循环开始前用UNG处理。
  引物设计不完善或模板浓度非常低。	重新检查引物设计及模板浓度。
  样品中的抑制成分影响反应。	重新纯化DNA。
  初始模板浓度低。	提高模板量。

• 标准曲线的C(t)和模板含量的对数值非线性相关。
  

  可能原因	意见和建议
  模板稀释不准确。	重新进行系列稀释并保证样品混合均匀。
  模板含量太高。	减少模板含量；提高反应液体积。
  模板含量太低。	提高模板含量。
  引物二聚体被共同扩增。	重新设计引物。