产品货号：
BTN131176
中文名称：
FFPE直接RT-PCR试剂盒
英文名称：
FFPE direct RT-PCR Kit
产品规格：
30T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒免核酸提取，直接用切片裂解液做RT-PCR模板。本试剂盒足够处理30次样品处理和50次的RT-PCR反应。
试剂盒特点：
试剂盒组成：
保存条件：-20℃保存，有效期一年。
使用方法：
一、样品RNA的释放
二、RT反应合成cDNA
三、PCR反应（30μL体系）
四、电泳检测
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试剂盒特点：
- 反转录可灵活选用随机引物、Oligo dT引物或专一引物，适合各种情况。
- PCR mix含有上样染料，所以PCR产物可直接上样电泳。
- 两管式操作，RT和PCR分步进行，便于单独优化RT反应和PCR反应的条件。
- 扩增效率高，最高可扩增1kb以上的RNA。
试剂盒组成：
| 组分 | 规格 |
| 免RNA提取FFPE溶液A | 30mL |
| 免RNA提取FFPE溶液B | 18mL |
| MMLV（含RI） | 100μL（红盖） |
| RT Buffer（含dNTP） | 250μL（白盖） |
| Oligo (dT)18引物(0.5μg/uL) | 50μL（绿盖） |
| 随机引物(0.2μg/uL) | 50μL（本色盖） |
| RNase-free水 | 1mL（亮黄盖） |
| PCR MagicMix 3.0，含染料 | 1mL（红盖） |
保存条件：-20℃保存，有效期一年。
使用方法：
一、样品RNA的释放
- 如果有N个样品，可设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用水作为制备的阴性对照，提取结束后最后得到模板DNA放冰上待用。
- 将5片厚度为6～8μm的石蜡包埋组织切片转移到1.5mL塑料离心管(最好使用螺旋盖离心管)中并加入1mL溶液A，在振荡器上以最大速度振荡10秒，然后离心。
- 取出上一步的上清液0.6mL，加入0.6mL的溶液B，震荡5～10秒。
- 室温放置10分钟。
- 混合液可以直接用做PCR、RT-PCR、LAMP和RT-LAMP扩增的模板。未用完的部分模板可以放-80℃长期保存。
二、RT反应合成cDNA
- 按下表配制RT反应体系（20μL体系）:
成分 用量 RNA模板 总RNA 100～500ng 或poly(A) mRNA 10～500ng 或专一的RNA（如体外转录制备的） 0.01pg～500ng 引物 Oligo (dT)18(0.5μg/μL) 1μL 或随机引物(0.2μg/μL) 1μL 或自备模板专一反向引物(10pmol/μL) 1～2μL RNase-free水 至12μL
注意：RNA样品不能含有基因组DNA污染。随机引物与RNA模板的比例将决定cDNA合成的平均长度（成反比）。一般情况下随机引物效率好于OligodT引物，但如果只想转录总RNA中的mRNA（只占5%左右），则可优先选用OligodT引物，这样就可以排除非mRNA的干扰。 - 70℃保温5分钟变性模板后立即冰浴。
- 按顺序加入6μL RT Buffer（含dNTP）和2μL MMLV逆转录酶（含RI），反应终体积为20μL。
- 42℃保温60分钟。此步为RT反应。
- 70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。
- 合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。
三、PCR反应（30μL体系）
- 将全部专用染料加入到PCR MagicMix 3.0中，轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料，但在PCR结束
后，电泳上样前，则需要加入电泳上样液，否则电泳时没法判断电泳速
度。 - 在PCR管中加入下列成分：
成分 用量 PCR MagicMix 3.0 15μL cDNA样品（上步的RT反应液） 1～5μL 模板专一性正向引物(10pmol/μL) 1～2μL 模板专一性反向引物(10pmol/μL) 1～2μL RNase-free水 至30μL
注意：cDNA也可以稀释后用作PCR模板。是否稀释或稀释多少倍完全取决于靶基因的丰度。 - PCR反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：
过程 温度 时间 预变性 95℃ 5min PCR反应（35个循环） 95℃ 30sec 55℃ 30sec 72℃ 20sec 最后延伸 72℃ 7min
四、电泳检测
- 取5～10μL PCR产物直接在PAGE或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的PCR mix含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。
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