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AFLP试剂盒(EcoRI-MseI)图片
产品货号:
BTN100903
中文名称:
AFLP试剂盒(EcoRI-MseI)
英文名称:
AFLP Kit(EcoRI-MseI)
产品规格:
1600T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本制品在传统AFLP-PCR的基础上经过精心优化而开发的试剂盒。




AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增片段长度多态性)是一种结合RFLP和PCR技术特点的分子标记分型技术,用于快速寻找物种专一性、亚种专一性、甚至个体专一性的DNA片段。




AFLP原理


  • 一站式,足够50次酶切-连接反应、50次预扩反应和1500次AFLP PCR(30μL体系计算),但不包括DNA纯化和带型分析试剂(如PAGE电泳试剂和银染试剂)。
  • 本制品提供EcoRI-MseI组合,适用于GC含量在50%以上的基因组。对GC含量在50%以下的基因组,需从本公司选购AFLP试剂盒(EcoRI-TaqI)
  • 各种参数都经过优化,一次PCR所得AFLP片段数一般在10~100之间,可重复性好,误差小于0.6%。
  • 本制品适用于基因组在500 Mb-6000 Mb的材料(如动物和植物)。对于基因组在50-500 Mb的材料(如细菌和真菌)或50Mb以下的材料(如质粒,cosmid,BAC,YAC和PAC等),需要分别另购+0型预扩增引物对和+2型扩增引物。
  • 本制品只能用于科研。



包装成分规格
AFLP酶切-连接-预扩增相关成分10×AFLP酶切-连接Buffer100μL
AFLP EcoRI-MseI酶混合液50μL
AFLP EcoRI-MseI接头干粉50次
AFLP EcoRI-MseI接头溶解液1mL
+1型EcoRI-MseI预扩增引物干粉50次
T4 DNA连接酶(5U/μL)50μL
AFLP +3型EcoRI引物系列E-AAC引物干粉1 OD
E-AAG引物干粉1 OD
E-ACA引物干粉1 OD
E-ACT引物干粉1 OD
E-ACC引物干粉1 OD
E-ACG引物干粉1 OD
E-AGC引物干粉1 OD
E-AGG引物干粉1 OD
AFLP +3型MseI引物系列M-CAA引物干粉1 OD
M-CAC引物干粉1 OD
M-CAG引物干粉1 OD
M-CAT引物干粉1 OD
M-CTA引物干粉1 OD
M-CTC引物干粉1 OD
M-CTG引物干粉1 OD
M-CTT引物干粉1 OD
AFLP PCR成分2×PCR MasterMix(含示踪剂)5mL×6

保存:-20℃,有效期1年。




超纯水、Southern级DNA纯化试剂,尿素-PAGE电泳套装,银染试剂盒。


一、DNA提取(本试剂盒不提供相关试剂)
  1. 用户需要自备50~500ng Southern级别的基因组DNA。DNA酶切彻底是AFLP成功的关键,所以最好先预实验以确保DNA能够被EcoRI和MseI内切酶彻底切开。


二、限制性内切酶酶切和DNA-接头连接反应
本试剂盒足够50次20μL体系的酶切-连接反应
  • 在0.2mL离心管中设置20μL的限制性内切酶酶切反应:
    成分用量
    10×AFLP酶切-连接Buffer2μL
    样品DNA对小基因组材料50ng
    对大基因组材料500ng
    AFLP EcoR I-Mse I酶混合液1μL
    自备超纯水至20μL
  • 轻柔混匀并短暂离心后,37℃保温2小时酶切(若PCR仪器不带热盖,则必须加50μL自备石蜡油,否则水分会蒸发影响反应。下同)。反应结束后70℃保温15分钟灭活酶。
  • 在体系中加入20μL AFLP EcoRI-MseI接头混合物和1μL T4 DNA连接酶,5U/uL,轻柔混匀并短暂离心,20℃保温3小时让接头跟酶切DNA片段连接。第一次使用本试剂盒时,需要把本试剂盒提供的1mL AFLP EcoRI-MseI接头溶解液加入到AFLP EcoRI-MseI接头干粉管,涡旋震荡半分钟,短暂离心,然后再取用。没有用完的需要放-20℃保存。
  • 反应结束后直接在40μL的连接反应体系中加入自备360μL超纯水,得到连接液10倍稀释液,直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用。


三、预扩增
本试剂盒足够40次30μL体系的预扩增反应
  1. 在0.2mL离心管中设置30μL的预扩PCR体系。首次使用本试剂盒时,需要在本试剂盒提供的+1型EcoRI-MseI预扩增引物干粉管中加入100μL自备超纯水,涡旋震荡半分钟混匀,短暂离心后直接取用。没有用完的部分,需要放-20℃保存:
    成分用量
    连接液10倍稀释液(来于第4步)5μL
    +1型EcoRI-MseI预扩增引物10μL
    2×PCR MasterMix15μL
  2. 离心数秒,按下列参数进行PCR预扩增(第一步是预合成,跟常规PCR不同):预合成72℃ 2分钟,PCR循环20次(94℃ 30S,56℃ 60S,72℃ 60S)
  3. 取10μL PCR产物在1.5%琼脂糖胶上电泳检测,产物应为大小在100~1500bp的模糊条带。本试剂盒的2×PCR MasterMix含上样液和示踪染料,故不需要额外加Loading Buffer。示踪染料的泳动速度相当于50bp的DNA片段。
  4. 在剩下的20μL预扩增反应液中加入980μL自备超纯水,相当于稀释50倍,所得50倍PCR模板稀释液将直接作为模板用于下步扩增或放-20℃保存待用。


四、选择性PCR扩增
  1. 制备引物:在本试剂盒提供的8只+3型EcoRI引物干粉和8只+3型MseI引物干粉中,每管分别加入1100μL自备超纯水,震荡混匀得16管引物母液。每管取66μL引物母液与1034μL超纯水在1.5mL离心管中混合得1100μL每个引物的相应工作液,共16管引物工作液。
  2. 在0.2mL PCR管中,加入下列成分(第一次PCR时需要测试所有8×8=64种引物组合,需设置64个PCR反应。若已知哪个一种或几种引物组合适合,则可以直接使用选中的引物),下面以一种+3型EcoR I引物和+3型Mse I引物组合为例:
    成分用量
    50倍PCR模板稀释液5μL
    AFLP+3型EcoR I引物工作液(八种之一)5μL
    AFLP+3型Mse I引物工作液(八种之一)5μL
    2×PCR MasterMix15μL
  3. 轻柔混匀后离心数秒,按下列参数进行PCR:
    过程温度时间
    PCR 13次循环94℃30秒
    65℃30秒(每次循环递减0.7℃)
    72℃60秒
    PCR 23次循环94℃30秒
    55℃30秒
    72℃60秒
    延伸72℃5分钟


五、尿素-PAGE电泳和银染
注:需另购试剂并按相关手册进行
  1. PCR结束后进行尿素-PAGE电泳和银染分析,本试剂盒不含相关试剂。

相关搜索:AFLP试剂盒(EcoRI-MseI)AFLP试剂盒扩增片段长度多态性EcoRI-MseIAFLP Kit(EcoRI-MseI)
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