产品货号:
BM0351
中文名称:
抗体修饰热启动Taq PCR预混液(染料法)
英文名称:
2×HotStart Taq SYBR Green qPCR MasterMix
产品规格:
5mL
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品是SYBR Green I嵌合染料法专用qPCR试剂,为2×预混液,包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分,可减少操作步骤,缩短加样时间,降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶,配合精心优化的Buffer体系以及PCR反应促进因子,使产品具有特异性强、扩增效率高等特点,有效抑制非特异性扩增,可对宽广浓度范围的模板进行准确定量,获得稳定可靠的qPCR结果。
组分 | 规格 |
2×HotStart Taq SYBR Green qPCR MasterMix | 5×1mL |
Low ROX Dye (100×) | 100μL |
High ROX Dye (100×) | 100μL |
保存:-20℃,避光,避免反复冻融
- None ROX:Bio-Rad CFX全系列;Roche LightCycler系列;Eppendorf Mastercycler ep realplex系列;Qiagen/Corbett Rotor-Gene系列;Takara Thermal Cycler Dice;analytikjena qTOWER系列等。
- Low ROX:ABI 7500/7500 Fast,ABI ViiA 7;ABI QuantStudio系列;Stratagene Mx3000P/3005P/4000。
- High ROX:ABI 7000/7300/7700/7900 HT/7900 HT Fast,StepOne,StepOne Plus等。
- 因Mix中预混有染料,其保存或反应体系配制过程应避免强光照射;
- 使用前上下颠倒轻轻混匀Mix,请勿涡旋振荡混匀,避免产生过多气泡;
- 可在首次试验前根据“适配机型”表格内容选择合适的ROX Dye一次性加入Mix管内。加入终浓度为2×(1mL mix加入20μL ROX Dye)。
- 扩增产物长度建议控制在80~200bp;
- 引物长度为18~25bp;
- 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳,Tm值控制在58~62℃为佳;
- 引物的GC含量控制在40%~60%之间;
- 引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀,避开T/C或者A/G的连续结构(特别是3'端);
- 引物3'端最后一个碱基最好为G或者C;
- 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列;
- 使用NCBI BLAST功能检索确认引物的特异性。
若使用默认反应条件反应性能不佳时,则需要进行反应条件的优化,可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行:
- 引物浓度调整:当引物终浓度在0.1~1.0μM范围之间变化时,引物浓度越低,扩增特异性越高,但扩增效率会有所下降。
- 扩增程序优化:需提高扩增特异性,可使用两步法程序或提高退火温度;需提高扩增效率,可使用三步法程序或延长延伸时间。
- 建议的qPCR反应体系
成分 用量 终浓度 2×HotStart Taq SYBR Green qPCR MasterMix 10μL 1× 正向引物(10μM) 0.4μL 0.2μM 反向引物(10μM) 0.4μL 0.2μM ROX(依据机型选择) 0.2μL 1× DNA模板 X μl 10~200ng/20μL Nuclease-Free Water 至20μL - - 通常推荐的引物终浓度为0.2μM,反应效果不佳时可在0.1~1μM范围内进行调整;
- 推荐模板加样量为1~2μL,如模板类型为未稀释cDNA原液,模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同,必要时可进行梯度稀释,以确定最佳的DNA模板添加量。
- 通常推荐的引物终浓度为0.2μM,反应效果不佳时可在0.1~1μM范围内进行调整;
- qPCR反应程序(可根据机型适当调整)
- 两步法:
步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 30sec 1 变性 95℃ 10sec 40 退火&延伸 60℃ 30sec 熔解曲线 使用仪器默认采集程序 - 三步法:
步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 30sec 1 变性 95℃ 10sec 3 退火 55~65℃ 10sec 延伸 72℃ 30sec 熔解曲线 使用仪器默认采集程序
- 根据引物的Tm值进行退火&延伸(退火)温度的设定;若扩增片段在200bp以内,退火&延伸(延伸)时间可以设置为15sec;此外,退火&延伸(延伸)时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的最短数据采集时间自行调整;
- 不同qPCR仪的熔解曲线采集程序有差别,一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。
- 两步法:
问题描述 | 可能原因 | 解决办法 |
扩增曲线不光滑 | 荧光信号太弱,经系统校正后产生 | 确保Mix中预混的染料未降解;更换荧光信号收集更好的qPCR专用耗材。 |
扩增曲线断裂或下滑 | 模板浓度较高,基线的终点值大于Cq值 | 减小基线终点(Cq值-4),重新分析数据。 |
个别孔扩增曲线突然骤降 | 反应管内留有气泡 |
|
反应结束无扩增曲线出现 | 反应循环数偏少 | 设置循环数为40,但更多的循环数会增加过多的背景信号。 |
荧光信号采集步骤未设置或者设置错误 | 两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火&延伸阶段,三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。 | |
引物可能降解 | 长期未用的引物,应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除其降解的可能。 | |
模板浓度过低 | 减少模板稀释倍数重复实验,样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。 | |
模板降解 | 重新制备模板,重复实验。 | |
Cq值出现过晚 | 扩增效率低 | 提高引物浓度,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物。 |
模板浓度过低 | 减少模板稀释倍数重复实验,样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。 | |
模板降解 | 重新制备模板,重复实验。 | |
扩增产物过长 | 扩增产物长度控制在80~200bp。 | |
体系中存在PCR抑制剂 | 一般为模板带入,加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验。 | |
空白对照出现信号 | 反应体系污染 |
|
出现引物二聚体等非特异性扩增 |
| |
熔解曲线出现多峰 | 引物设计不佳 | 根据引物设计原则重新设计新引物。 |
引物浓度过高 | 适当降低引物浓度。 | |
cDNA模板存在基因组污染 | 提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化,例如:dsDNase,以去除基因组污染,或设计跨内含子引物。 | |
实验重复性差 | 加样误差大 |
|
模板浓度过低 | 减少模板稀释倍数重复实验 | |
qPCR仪不同位置的温度偏差 | 定期校准qPCR仪 |
相关搜索:抗体修饰热启动Taq PCR预混液(染料法),PCR扩增,DNA扩增,PCR预混液,PCR反应液,预混反应液,MasterMix,染料法,嵌合染料法,SYBR,Taq酶,Taq酶抗体,热启动,HotStart,荧光定量,qPCR,2×HotStart Taq SYBR Green qPCR MasterMix