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本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验配制的，能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录反应和PCR扩增反应。反应过程中无需打开管盖添加试剂，避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。

本试剂盒包括多点突变改造耐热反转录酶HotScript M-MuLV RTase、热启动Taq DNA聚合酶和RNase抑制剂、同时包含适用于逆转录和PCR扩增的优化独特反应体系。本酶HotScript M-MuLV RTase缺失了RNase H活性，与普通M-MuLV相比，具有更强的延伸能力和稳定性，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。同时该酶可以在高达50～60℃反转录，大大提高了复杂二级结构，GC含量丰富模板反转录效率，产量敏感度和特异性比一般试剂盒显著特高。

• 尽管反应体系中包含RNase抑制剂，实验过程中仍应特别注意避免RNase污染。
  
• 为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板。
  
• 不同的片段，所需最佳RNA模板用量不同，过多的RNA会抑制反应，建议根据反应调整模板用量。
  
• 不能使用Oligo(dT)和Random Primer合成cDNA。

• 根据下表于冰上配制反应液：
  

  成分	用量	终浓度
  2×RT-PCR Buffer	25μL	1×
  Forward Primer(10μM)	1μL	0.2μM
  Reverse Primer(10μM)	1μL	0.2μM
  Enzyme Mix	1μL	-
  HotScript M-MuLV RTase	1μL	-
  RNA模板	X μL	1pg～2μg
  RNase-free H2O	至50μL	-

  • 引物浓度请以终浓度0.2～0.6μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。如果同进行多个反应，先按比例配成混合液，振荡混匀后，按每管50-XμL (X为模板量)分装。
• PCR扩增：
  
  • 将配制好的反应体系混匀、离心后。
    
  • 将热循环仪预热到50～55℃，将PCR管置于热循环仪中。
    
  • 扩增程序：
    

    步骤	温度	时间	循环数
    反转录	50～55℃	30分钟	1
    初始变性	94℃	2～5分钟	1
    变性	94℃	30秒	30～40
    退火	50～60℃	30秒
    延伸	72℃	1～2kb/分钟
    最后延伸	72℃	5～10分钟	1
    保温	4℃

    • 可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。