产品货号:
ALH209
中文名称:
KOD DNA聚合酶
英文名称:
KOD DNA Polymerase
产品规格:
250U|500U
发货周期:
1~3天
产品价格:
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KOD DNA聚合酶是从克隆有Thermococcus Kodakaraensis DNA聚合酶基因的质粒在大肠杆菌中经诱导表达分离纯化而来。该酶所具有的超强3'→ 5'外切酶活性使得其扩增保真性比Pfu DNA Polymerase更高,保真性是Taq的约50倍,同时具有合成速度快的特点,聚合速度约为普通Pfu DNA Polymerase的5倍,Taq DNA Polymerase的2倍,达到100~138bp/秒,可以在短时间内获得高产量的扩增产物,特别适合于高保真地扩增6kb以内的PCR产物,扩增所得的DNA为平末端,可用于基因克隆、表达及突变分析等分子生物学实验。
75℃活性测定条件下,在30min内摄入10nmol的dNTPs使成为酸性不溶物时所需要酶的活性定义为1U。
PCR,尤其用于PCR产物的克隆,DNA片段的平滑化。
组分 | 250U | 500U |
KOD DNA Polymerase(5U/μL) | 50μL | 100μL |
10×KOD Buffer | 1mL | 1mL |
SuperPure dNTP mix(10mM Each) | 100μL | 200μL |
保存:-20℃
- 建议PCR条件(以50μL反应体系为例)
成分 用量 终浓度 模板 Variable <0.5μg Forward Primer 10μM 1μL 0.2μM Reverse Primer 10μM 1μL 0.2μM 10×KOD Buffer 5μL 1× dNTP Mixture(10mM each) 1μL 0.2mM KOD DNA Polymerase 0.25~0.5μL - dH2O 至50μL -
注意:- 用无菌PCR级别的水补至终体积50μL。实际操作中计算好需补加水的量后,建议先加水,然后按上述顺序添加其它成分,最后添加KOD DNA Polymerase。充分混匀后,离心数秒使反应混合物沉到管底。然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。
- 在冰浴上混合PCR各种成分,防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。
- 高保真KOD对于dNTP纯度要求很高,因此建议用本酶配套的超纯dNTP mix。
- 用无菌PCR级别的水补至终体积50μL。实际操作中计算好需补加水的量后,建议先加水,然后按上述顺序添加其它成分,最后添加KOD DNA Polymerase。充分混匀后,离心数秒使反应混合物沉到管底。然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。
- PCR条件的优化
- 质粒或者噬菌体模板:
模板量5~20ng,循环参数如下表:Cycling parameters <1kbp target DNA 1-2kbp target DNA 3-4kbp target DNA 5-6kbp target DNA Step 1 94℃ 2min 94℃ 2min 94℃ 2min 94℃ 2min Step 2 94℃ 20sec 94℃ 20sec 94℃ 20sec 94℃ 30sec Step 3 Ta 20sec Ta 20sec Ta 20sec Ta 30sec Step 4 72℃ 20sec 72℃ 30sec 72℃ 40sec 72℃ 60sec Step 5 72℃ 5min 72℃ 5min 72℃ 5min 72℃ 5min Repeat step 2-4 for 30-35cycles Ta= Tm-5℃ - 基因组DNA和cDNA模板:
基因组DNA模板量为50~100ng,1~2μL cDNA(起始转录用的RNA为500ng),循环参数如下表:Cycling parameters <2kbp target DNA Step 1 94℃ 2min Step 2 94℃ 20~30sec Step 3 Ta 15~20sec Step 4 72℃ 20~60sec Step 5 72℃ 5min Repeat step 2-4 for 30-35cycles Ta= Tm - 5℃
- 质粒或者噬菌体模板:
问题 | 可能的原因 | 解决方法 |
没有PCR产物 | 设计的扩增靶序列太长 | 设计稍短的扩增靶序列,以基因组DNA为模板KOD适合扩增不超过2kb左右的产物,以质粒和噬菌体DNA为模板适合扩增6kb以下的DNA。 |
PCR条带弥散 | 没有在冰上混合PCR反应液 | PCR反应液应该在冰上混合,KOD DNA聚合酶应该最后加,以防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。 |
KOD扩增延伸速度为1Kb/15~30秒,具有比其它聚合酶更快的延伸速度延伸时间过长,有时会有拖尾弥散效应。 | 如出现拖尾效应,可缩短退火延伸时间或者减少酶量。 | |
低产量 | 模板为高GC含量 | 加入DMSO 2-5%,由于该酶的耐热性好,在应用于GC含量高的模板等以及易产生高级结构的模板时,可在96℃以上进行变性。 |
模板量太低 | 提高模板量 |
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