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本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。本试剂盒包含miRNA荧光定量检测的所有试剂，包括2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer。2×miRNA qPCR Mix（含Sybr Green）是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，其中的DNA polymerase采用的是抗体修饰的热启动形式，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。

• 分子生物学实验级别的水（无核酸酶）。
  
• 待检测miRNA对应的qPCR上游引物（Forward primer）。

• 遵循引物设计的最普遍原则。
  
• 以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。
  
• 试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在65℃左右。
  
• 若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G或C碱基）；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。
  
• 若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。

• 使用前充分融解混匀。2×miRNA qPCR Mix短期使用可放在4℃，避免反复冻融。Reverse primer每次用完置-20℃保存。
  
• miRNA第一链cDNA的加入量不要超过real time PCR体积1/10。
  
• 对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。
  
• 本品中含有荧光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
  
• 2×miRNA qPCR Mix不含参比染料ROX，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
  
• 本试剂盒须与 miRNA荧光定量检测试剂盒（ALH189）配套使用。

• 在室温融化2 x miRNA qPCR Mix和Reverse primer（10μM）。
  
• 使用时请将2 x miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。注：请不要使用振荡器混匀。
  
• 按照下表组分冰上进行反应液的配制。
  

  成分	50μL体系	20μL体系	终浓度
  2×miRNA qPCR Mix(With SYBR Green)	25μL	10μL	1×
  10μM Forward primer	1μL	0.4μL	0.2μM
  10μM Reverse primer	1μL	0.4μL	0.2μM
  miRNA第一链cDNA	x μl	x μL	-
  ddH2O	至50μL	至20μL	-

  
  
• PCR程序设置
  提高特异性选择两步法。提高扩增效率选择三步法。
  
  • PCR循环（三步法）
    

    温度	时间	循环数
    94℃	2～3min	1
    94℃	10～20sec	35～45
    55～65℃	10～20sec
    72℃	20～60sec
    Dissociation Stage

    
    
  • PCR循环（二步法）
    

    温度	时间	循环数
    94℃	2～3min	1
    94℃	15～20sec	35～45
    60℃	40sec
    Dissociation Stage