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本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析小鼠血清、血浆、细胞裂解液或细胞培养上清中PCSK9的含量。

预先包被的抗体为多克隆抗体。检测相抗体为多克隆抗体，经生物素(biotin)标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠PCSK9呈正相关。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因属于前蛋白转化酶(PC)家族，由信号肽、结构域、催化结构域和羧基末端结构域组成。PCSK9能介导低密度脂蛋白手提(LDLR)降解，调节血浆LDL水平。

检测指标：PCSK9；NARC-1
检测范围：0.156ng/mL～10ng/mL
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应
敏感性：＜ 6pg/mL

组分	规格
预包被抗小鼠PCSK9抗体的96孔板	96T
重组小鼠PCSK9标准品(冻干)	10ng×2
生物素标记抗小鼠PCSK9	100μL
亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)	100μL
样品稀释液	30mL
抗体稀释液	12mL
ABC稀释液	12mL
TMB显色液	10mL
终止液	10mL
25×洗涤缓冲液	20mL
封板膜	4张

保存：2～8℃，有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。

• 标准规格酶标仪。
  
• 自动洗板机。
  
• 恒温箱
  
• 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。
  
• 干净的试管和Eppendof管。
  
• 用去离子水将25×洗涤缓冲液稀释25倍，成1×洗涤缓冲液。

• 使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与我司联系。
  
• 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
  
• 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
  
• 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
  
• 禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
  
• 本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
  
• 揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

• 手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1×洗涤缓冲液至少0.3mL注入孔内，浸泡1～2分钟。根据需要，重复此过程数次。
  
• 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

• 血清：用干净试管收集血液，凝固2小时后离心1000×g15分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
  
• 血浆：采用肝素抗凝，抽血后30分钟内离心1000×g15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
  
• 细胞培养上清：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
  
• 细胞裂解液：
  
  • 对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。
  • 对于悬浮细胞：离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。

• 高含量：指待测因子在100～1000ng/mL。一般按1∶100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
  
• 中含量：指待测因子在10～100ng/mL。一般按1∶10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
  
• 低含量：指待测因子在0.156～10ng/mL。按1∶2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
  
• 特低含量：指待测因子≤0.156ng/mL。样品一般不做稀释，按每孔100μL样品直接加入。

• 小鼠PCSK9标准品的稀释和使用(在使用前2小时内准备)。
  试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
  
  • 配制10ng/mL标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
    
  • 配制5～0.156ng/mL标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3mL样品稀释液，分别标记上5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156ng/mL。取0.3mL 10ng/mL的标准品加入标记5ng/mL的管中，混匀后同样取出0.3mL，加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。
    
    已经稀释的标准品(10ng/mL)，应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用，不能反复冻融。
  
  
• 生物素标记抗小鼠PCSK9抗体工作液(在使用前2小时内准备)：
  
  • 根据每孔需要100μL计算总的用量(实际配制时应多配制100～200μL)。
    
  • 按1μL生物素标记抗小鼠PCSK9加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
• 亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备(在使用前1小时内准备)：
  
  • 根据每孔需要100μL计算总的用量(实配时应多配制100～200μL)。
    
  • 按1μL亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。

已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。

• 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
  
• 将10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156ng/mL的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液作为零孔。对于血清、细胞裂解液或细胞培养上清，每孔加100μL已用样品稀释液稀释的样品。
  
• 酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
  
• 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
  
• 将准备好的生物素抗小鼠PCSK9抗体工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。
  
• 酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
  
• 1×洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
  
• 将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。
  
• 酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
  
• 1×洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
  
• 按每孔依次加入90μL TMB显色液，37℃避光反应15～20分钟
  显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显。
  
  
• 按每孔100μL依次加入终止液，此时蓝色立转黄色。
  
• 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
  两种设定空白对照的方案：
  
  • 将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
    
  • 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
• 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

• 加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
  
• 加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1×洗涤缓冲液洗涤3次。
  
• 加ABC，37℃反应30分钟。1×洗涤缓冲液洗涤5次。
  
• TMB 37℃反应15～20分钟。
  
• 加入终止液，读数。

TMB 37℃反应15分钟，不同用户最佳显色时间会有所不同。取自某些批次质检数据，仅供参考，用户需要自己建立标准曲线。

浓度(ng/mL)	0.0	156	313	625	1250	2500	5	10
OD值	0.136	0.226	0.314	0.403	0.753	1.244	1.860	2.253

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