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本试剂盒主要用于免疫组织化学中辣根过氧化物酶(HRP)聚合酶的显色。

辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物，聚合物上的HRP催化底物H2O2与DAB反应，从而在显微镜下显示出组织片中的特定抗原的位点。

• 应用适当的防护措施，以避免试剂同皮肤和眼睛接触。
  
• 染色液中的DAB底物液为致癌物质，操作中应采用合理的防护措施。
  
• 若将本染色液中的组分与其他公司的产品混合使用，在染色过程中可能出现异常情况。
  
• 超过有效期的试剂活性可能降低，因此不得使用过期的试剂盒。
  
• 脱蜡不彻底，容易影响染色效果，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开。
  
• 为防止可能出现的假阳性、假阴性结果，在实验过程中需设置阳性与阴性对照。
  
• 实验中滴加试剂时，过多的PBS缓冲液会导致试剂被稀释，将引起染色强度变弱，因此，滴加试剂前应除去多余的缓冲液。

• 所需仪器和耗材：移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。
  
• 试剂准备：内源性过氧化物酶阻断剂、免疫组织化学检测用一抗和二抗、PBS缓冲液。
  
• 操作程序：
  
  • 脱蜡和水化：
    ① 石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×3次；
    ② 去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟×3次；
    ③ 去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡3分钟×2次；
    ④ 去除多余的液体后，置于75%乙醇中，浸泡3分钟×2次；
    ⑤ 蒸馏水冲洗1分钟，置于PBS缓冲液中。
    
  • 抗原修复：参见一抗说明书。
    
  • 阻断内源性过氧化物酶：加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。
    
  • 滴加一抗：根据组织大小，滴加100μL或适量的一抗，37℃孵育60分钟或2～8℃过夜；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。
    
  • 滴加酶标二抗：滴加100μL或适量的HRP酶标记羊抗鼠/兔IgG聚合物，37℃孵育20分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。
    
  • DAB显色液配制：在试剂配制专用瓶中依次加入1mL DAB底物液、50μL 20×DAB，混匀。
    
    • 配制好的DAB显色液2～8℃避光存放，现配现用。
  • DAB显色：加入适量新鲜配制的DAB显色液，室温孵育5～10分钟。
    
  • 复染：自来水冲洗，苏木素染色液孵育30～60秒；分化、冲洗返蓝。
    
  • 酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
• 结果判定：染色结果在光学显微镜下观察并进行判读。
  
  • 阳性：检测组织目标细胞的目的抗原可观察到棕黄色显色。
    
  • 阴性：检测组织目标细胞的目的抗原末观察到棕黄色显色。