产品货号:
ZN1926
中文名称:
增强型化学发光法显色试剂盒(兔IgG,Western)
英文名称:
Enhanced Chemiluminescent Method Kit of Western Blotting
产品规格:
10T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒适用于一抗类型为兔IgG的Western Blotting检测实验中的增强化学发光法(ECM)显色。
保存:2~8℃,有效期1年。
每个试剂盒足够10张小膜或800cm2面积的膜显色。
对照的设置:
内参照:提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白;
阳性对照:即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量;
阴性对照:即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞。
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组分 | 规格 | 说明 |
封闭试剂 | 10g | 蛋白质干粉(脱脂奶粉)。 |
HRP标记羊抗兔IgG | 100μL | 亲和纯化抗体,经过人血清吸附以去除交叉抗体。效价1:2000~10000。 |
显色剂A液 | 5mL | 20×浓缩液 |
显色剂B液 | 5mL | 20×浓缩液 |
保存:2~8℃,有效期1年。
每个试剂盒足够10张小膜或800cm2面积的膜显色。
- 蛋白样品制备:
- 细胞培养蛋白质样品的制备:
- 胰酶消化后裂解:细胞培养至80%左右密度时,以含0.25%胰蛋白酶消化,室温,低速心,弃上清。细胞经预冷的PBS漂洗3次,加入0.1~1mL裂解液(根据细胞数量定)反复吹打。
- 皿上直接裂解:细胞培养至80%左右密度时,细胞经预冷的PBS漂洗3次,加入0.1~1mL裂解液(根据细胞数量定),用细胞刮刀收集,转移至离心管中,反复吹打。
- 胰酶消化后裂解:细胞培养至80%左右密度时,以含0.25%胰蛋白酶消化,室温,低速心,弃上清。细胞经预冷的PBS漂洗3次,加入0.1~1mL裂解液(根据细胞数量定)反复吹打。
- 组织样品的制备:新鲜组织块迅速置于预冷的生理盐水中,漂洗数次,按组织净重∶裂解液=1∶10的比例,加入相应体积的裂解液进行匀浆,离心收集上清(如有粘稠物可超声处理)
- 蛋白变性:处理后的样品加入样品缓冲液(按样品浓度1∶1或1∶2的比例)混匀,样品置100℃的水浴箱加热3~5min,10000g离心10min,取上清液。
- 样品可立即使用也可以分装冻存,-20℃可稳定保持数月。
- 细胞培养蛋白质样品的制备:
- SDS-PAGE电泳:
- 制胶:
① 按比例配制分离胶(丙烯酰胺母液:单体:双体=29:1),缓缓地摇动溶液,使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中,再在液面上小心注入一层水或正丁醇,以阻止氧气进入凝胶溶液中,37℃恒温箱中静置60min。
② 同前按比例配制浓缩胶,但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多的氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,以连续平稳的液流注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,37℃恒温箱中静置60min以上以保证完全聚合。 - 加样:
依次加入标准品和待分析样品。(加样时间要尽量短,以免样品扩散,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。样品一般在1.0mm厚的胶加样50~100μg/lane)。 - 电泳:
加样完毕,选择适当的电压进行电泳即可。一般采用恒压浓缩胶55V,分离胶75V,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳。
- 制胶:
- 转膜:
蛋白质经SDS-PAGE分离后,从凝胶中转移到固相支持物上,常用的支持物有:硝酸纤维膜(NC膜)或PVDF膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后,取出凝胶,在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法,包括湿式电转印和干式电转印。- 干式电转印:将转印槽阴极平放工作台上,并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸,将电转印液浸透0.45μm的NC膜放在滤纸上,再将凝胶平放在NC膜上,最后在凝胶上加盖三层电转印液浸透1mm厚的滤纸,电流根据凝胶面积按1-2mA/cm2,接通电源,经1~1.5小时电转印。
- 湿式电转印:打开电转印夹,每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海绵垫,再各放三块转印液浸透的滤纸,滤纸与海绵垫大小相同或与NC膜、凝胶大小相同均可,将凝胶平放在阴极侧滤纸上,最后将NC膜平放在凝胶上,按照(-)夹板-海绵-滤纸-胶块-NC膜-滤纸-海绵-夹板(+)装好,依次除尽每层间气泡,夹好电转印夹。电泳槽加满预冷电转印液,插入电转印夹,将电泳槽放入冰箱内,连接好电极,接通电流,转印夹的NC膜应对电泳槽的正极,4℃ 250-300mA,转印80min(根据分子量不同,转印时间可适当调整)。
- 干式电转印:将转印槽阴极平放工作台上,并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸,将电转印液浸透0.45μm的NC膜放在滤纸上,再将凝胶平放在NC膜上,最后在凝胶上加盖三层电转印液浸透1mm厚的滤纸,电流根据凝胶面积按1-2mA/cm2,接通电源,经1~1.5小时电转印。
- 膜的封闭:
漂洗转印膜,室温,3次×10min,以尽量洗去转印膜上的SDS(以免影响抗体的结合),放入0.02M TBS缓冲液配制的5%脱脂奶粉和1%的BSA混合的封闭液内,摇床摇动,室温封闭2h,4℃过夜。1×TBS-T(pH7.6)洗液,室温漂洗10min。 - 抗体杂交:
- 封闭后的杂交膜放入杂交袋中,加入用0.02M TBS缓冲液配制的2%脱脂奶粉和1%的BSA混合的稀释液适当稀释的一抗,4℃孵育过夜或37℃孵育2h,1×TBS-T(pH7.6)洗液洗膜3次×10min。
- 一抗的稀释度,孵育时间,温度与显色强度,背景有直接关系。一般来说,阳性不强时可提高一抗浓度和延长孵育时间,而背景高,非特异性条带多,则降低抗体浓度和孵育时间。
- 用0.02M TBS缓冲液配制的2%脱脂奶粉和1%的BSA混合的稀释液适当稀释过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG孵育膜,20~37℃ 1.5小时或4℃过夜,1×TBS-T洗膜3×10min。
- 封闭后的杂交膜放入杂交袋中,加入用0.02M TBS缓冲液配制的2%脱脂奶粉和1%的BSA混合的稀释液适当稀释的一抗,4℃孵育过夜或37℃孵育2h,1×TBS-T(pH7.6)洗液洗膜3次×10min。
- ECM显色:
- ECM显色液配制:按1mL蒸馏水,加显色剂A液、B液各1滴混匀。
- 将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的ECM显色液反应约1~5min。吸去印迹膜边缘显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,以确保X感光胶片的干燥。印迹膜转入暗室中使胶片曝光30秒~5分钟。
- ECM显色液配制:按1mL蒸馏水,加显色剂A液、B液各1滴混匀。
- 显影、定影:
将曝光后的X感光胶片放入显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止,再放入定影液中定影,胶片可长期保存。
对照的设置:
内参照:提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白;
阳性对照:即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量;
阴性对照:即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞。
相关搜索:增强型化学发光法显色试剂盒(兔IgG,Western),化学发光法,Western Blot,免疫印迹,ECM显色,兔源一抗