产品货号：
ZN1926
中文名称：
增强型化学发光法显色试剂盒(兔IgG，Western)
英文名称：
Enhanced Chemiluminescent Method Kit of Western Blotting
产品规格：
10T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本试剂盒适用于一抗类型为兔IgG的Western Blotting检测实验中的增强化学发光法(ECM)显色。
保存：2～8℃，有效期1年。
每个试剂盒足够10张小膜或800cm2面积的膜显色。
对照的设置：
内参照：提示系统的稳定性，一般是一些管家蛋白；
阳性对照：即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞，同时可以提示你一抗的质量；
阴性对照：即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞。
相关搜索：增强型化学发光法显色试剂盒(兔IgG，Western)，化学发光法，Western Blot，免疫印迹，ECM显色，兔源一抗
| 组分 | 规格 | 说明 |
| 封闭试剂 | 10g | 蛋白质干粉（脱脂奶粉）。 |
| HRP标记羊抗兔IgG | 100μL | 亲和纯化抗体，经过人血清吸附以去除交叉抗体。效价1:2000～10000。 |
| 显色剂A液 | 5mL | 20×浓缩液 |
| 显色剂B液 | 5mL | 20×浓缩液 |
保存：2～8℃，有效期1年。
每个试剂盒足够10张小膜或800cm2面积的膜显色。
- 蛋白样品制备：
- 细胞培养蛋白质样品的制备：
- 胰酶消化后裂解：细胞培养至80%左右密度时，以含0.25%胰蛋白酶消化，室温，低速心，弃上清。细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入0.1～1mL裂解液(根据细胞数量定)反复吹打。
- 皿上直接裂解：细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入0.1～1mL裂解液(根据细胞数量定)，用细胞刮刀收集，转移至离心管中，反复吹打。
- 胰酶消化后裂解：细胞培养至80%左右密度时，以含0.25%胰蛋白酶消化，室温，低速心，弃上清。细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入0.1～1mL裂解液(根据细胞数量定)反复吹打。
- 组织样品的制备：新鲜组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，按组织净重∶裂解液=1∶10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理）
- 蛋白变性：处理后的样品加入样品缓冲液（按样品浓度1∶1或1∶2的比例）混匀，样品置100℃的水浴箱加热3～5min，10000g离心10min，取上清液。
- 样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃可稳定保持数月。
- 细胞培养蛋白质样品的制备：
- SDS-PAGE电泳：
- 制胶：
① 按比例配制分离胶（丙烯酰胺母液：单体：双体=29：1），缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，37℃恒温箱中静置60min。
② 同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多的氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，37℃恒温箱中静置60min以上以保证完全聚合。 - 加样：
依次加入标准品和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。样品一般在1.0mm厚的胶加样50～100μg/lane)。 - 电泳：
加样完毕，选择适当的电压进行电泳即可。一般采用恒压浓缩胶55V，分离胶75V，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。
- 制胶：
- 转膜：
蛋白质经SDS-PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纤维膜(NC膜)或PVDF膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，包括湿式电转印和干式电转印。- 干式电转印：将转印槽阴极平放工作台上，并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸，将电转印液浸透0.45μm的NC膜放在滤纸上，再将凝胶平放在NC膜上，最后在凝胶上加盖三层电转印液浸透1mm厚的滤纸，电流根据凝胶面积按1-2mA/cm2，接通电源，经1～1.5小时电转印。
- 湿式电转印：打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海绵垫，再各放三块转印液浸透的滤纸，滤纸与海绵垫大小相同或与NC膜、凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，按照(-)夹板-海绵-滤纸-胶块-NC膜-滤纸-海绵-夹板(+)装好，依次除尽每层间气泡，夹好电转印夹。电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极，4℃250-300mA，转印80min（根据分子量不同，转印时间可适当调整）。
- 干式电转印：将转印槽阴极平放工作台上，并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸，将电转印液浸透0.45μm的NC膜放在滤纸上，再将凝胶平放在NC膜上，最后在凝胶上加盖三层电转印液浸透1mm厚的滤纸，电流根据凝胶面积按1-2mA/cm2，接通电源，经1～1.5小时电转印。
- 膜的封闭：
漂洗转印膜，室温，3次×10min，以尽量洗去转印膜上的SDS(以免影响抗体的结合)，放入0.02M TBS缓冲液配制的5%脱脂奶粉和1%的BSA混合的封闭液内，摇床摇动，室温封闭2h，4℃过夜。1×TBS-T(pH7.6)洗液，室温漂洗10min。 - 抗体杂交：
- 封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入用0.02M TBS缓冲液配制的2%脱脂奶粉和1%的BSA混合的稀释液适当稀释的一抗，4℃孵育过夜或37℃孵育2h，1×TBS-T(pH7.6)洗液洗膜3次×10min。
- 一抗的稀释度，孵育时间，温度与显色强度，背景有直接关系。一般来说，阳性不强时可提高一抗浓度和延长孵育时间，而背景高，非特异性条带多，则降低抗体浓度和孵育时间。
- 用0.02M TBS缓冲液配制的2%脱脂奶粉和1%的BSA混合的稀释液适当稀释过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG孵育膜，20～37℃ 1.5小时或4℃过夜，1×TBS-T洗膜3×10min。
- 封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入用0.02M TBS缓冲液配制的2%脱脂奶粉和1%的BSA混合的稀释液适当稀释的一抗，4℃孵育过夜或37℃孵育2h，1×TBS-T(pH7.6)洗液洗膜3次×10min。
- ECM显色：
- ECM显色液配制：按1mL蒸馏水，加显色剂A液、B液各1滴混匀。
- 将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上混合好的ECM显色液反应约1～5min。吸去印迹膜边缘显色液，将一透明的玻璃纸盖住抚平，以确保X感光胶片的干燥。印迹膜转入暗室中使胶片曝光30秒～5分钟。
- ECM显色液配制：按1mL蒸馏水，加显色剂A液、B液各1滴混匀。
- 显影、定影：
将曝光后的X感光胶片放入显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，再放入定影液中定影，胶片可长期保存。
对照的设置：
内参照：提示系统的稳定性，一般是一些管家蛋白；
阳性对照：即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞，同时可以提示你一抗的质量；
阴性对照：即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞。
相关搜索：增强型化学发光法显色试剂盒(兔IgG，Western)，化学发光法，Western Blot，免疫印迹，ECM显色，兔源一抗