本制品是一种从完成转印的印迹膜到获得带GFP标签的融合蛋白条带的超快速Western检测试剂盒，仅需10分钟即可完成。本试剂盒包含了Anti-GFP Tag-HRP、FastBlock封闭和抗体稀释液、Western洗涤液、以及BalbECL Star化学发光试剂的试剂盒，一抗和二抗孵育合并为一步操作，使用便捷，背景低，包含从封闭到化学发光的整套试剂，转膜完成后通常10分钟就可以得到高质量的标签蛋白Western结果，可以极大加快标签蛋白的检测速度。
本试剂盒中的FastBlock封闭和抗体稀释液，可同时用于印迹膜的封闭和抗体的稀释。封闭时间仅需1分钟，总体效果显著优于传统的基于BSA(牛血清白蛋白)、脱脂奶粉、酪蛋白(Casein)等的封闭液。本制品稀释和配制的标签抗体工作液，可以在4℃保存和使用不少于1个月，并且可以重复使用。
本试剂盒使用了Anti-GFP Tag-HRP，因此一抗和二抗的孵育仅需一步即可完成。抗体特异性高、灵敏度极佳，使用浓度经过优化，按照1:500比例稀释，室温通常孵育5分钟即可进行后续的洗涤和检测。
本试剂盒中提供的BalbECL Star化学发光试剂，灵敏度高、背景极低、发光时间长，适用于大多数常规的Western检测。特殊情况下，如果成像效果需要优化，可根据当前实验结果选择灵敏度更高的BalbECL UT或BalbECL SuperUT。
| 组分 | 6T | 30T |
| Anti-GFP Tag-HRP | 20μL | 100μL |
| FastBlock封闭和抗体稀释液 | 40mL | 200mL |
| Western洗涤液 | 200mL | 2×500mL |
| BalbECL Star A液 | 3mL | 15mL |
| BalbECL Star B液 | 3mL | 15mL |
保存：-20℃，有效期1年。
FastBlock封闭和抗体稀释液、Western洗涤液以及BalbECL Star A液和B液，4℃保存，至少6个月有效。
如果检测的是6.6×8.5cm印迹膜，按照每次Western封闭需要FastBlock封闭和抗体稀释液5mL，稀释抗体需要FastBlock封闭和抗体稀释液5mL，抗体10μL，稀释后的抗体共计可以使用3次，洗涤液每次使用10mL，化学发光试剂工作液每次需要1mL计算，本试剂盒两个规格分别可以进行6次和30次GFP Tag的Western快速检测。如果检测的是更常见的裁切后的约2×8.5cm印迹膜，按照封闭以及抗体孵育液体用量为每次2mL，洗涤液用量每次4mL，发光试剂工作液用量每次0.4mL计算，两个规格分别可以检测15次和75次。
- 请注意回收使用过的抗体工作液。回收的抗体工作液可以再重复使用2次。稀释后的抗体，包括使用过的抗体工作液，请4℃保存。
- 回收后重复使用的抗体工作液，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000×g离心1～3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体工作液出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。
- 使用本制品，通常10分钟可得到高质量的标签蛋白Western结果，即封闭1分钟、抗体孵育5分钟、洗涤30秒3次、BalbECL试剂孵育1分钟、成像通常0.5分钟之内。
- 个别情况，如果希望获得到更好的Western结果，可适当增加封闭、抗体孵育及洗涤的时间，并适当优化成像的曝光时间。
- BalbECL Star A液和B液均对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
- 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用本试剂盒从完成转印的印迹膜开始实际操作约10分钟，检测获得的GFP Tag条带的效果，请参见图1。
图1．GFP标签蛋白检测试剂盒(Western方法)的检测效果图。每组实验从左到右为1μg、2μg、5μg、10μg总蛋白量的含GFP标签融合蛋白HEK293细胞裂解液，Western印迹成像由化学发光成像系统完成。根据灰度分析，各蛋白裂解液样品的GFP Tag条带灰度与上样量成相应的比例关系。实际实验结果会因样品、抗体、实验条件等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
以6.6×8.5cm的印迹膜为例：
- 膜的封闭：
- 完成转膜后，立即把印迹膜(约6.6×8.5cm)放置到预先加入5mL FastBlock封闭和抗体稀释液的Western洗膜盒中，置于翘板摇床上缓慢摇动，室温封闭1分钟。推荐使用BeyoShaker数字式翘板摇床(E6673)。后续如果无特殊说明，各种试剂的用量都以约6.6×8.5cm大小的印迹膜为例进行说明。
- 经反复测试，室温封闭1分钟即可达到理想的封闭效果，但也可以根据实际情况酌情延长封闭时间。如果需要更多的封闭液，推荐FastBlock Western封闭液。
- 如果使用裁切后的约2×8.5cm印迹膜，推荐使用2mL FastBlock封闭和抗体稀释液。
- 完成转膜后，立即把印迹膜(约6.6×8.5cm)放置到预先加入5mL FastBlock封闭和抗体稀释液的Western洗膜盒中，置于翘板摇床上缓慢摇动，室温封闭1分钟。推荐使用BeyoShaker数字式翘板摇床(E6673)。后续如果无特殊说明，各种试剂的用量都以约6.6×8.5cm大小的印迹膜为例进行说明。
- 抗体孵育：
- Anti-GFP Tag-HRP抗体工作液的配制。推荐抗体稀释比例为1:500，例如在5mL FastBlock封闭和抗体稀释液中加入10μL Anti-GFP Tag-HRP，即可得到5mL Anti-GFP Tag-HRP抗体工作液。
- 通常1:500稀释可以适用于大多数情况，但如果遇到样品中目的蛋白过少或过多时，也可以根据实际情况在1:250～1:1000范围内进行调整。如果需要更多的抗体稀释液，推荐Western一抗稀释液。
- 用微型台式真空泵、移液器或滴管等吸尽用于封闭的FastBlock封闭和抗体稀释液。
- 加入5mL Anti-GFP Tag-HRP抗体工作液。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，推荐用量为2mL。
- 置于翘板摇床上缓慢摇动，室温孵育5分钟。
- 经反复测试，室温孵育5分钟即可达到理想检测效果，但也可以根据实际情况酌情延长抗体孵育时间。
- 回收抗体工作液，留待后续重复使用。
- 使用Western洗涤液洗涤3次，每次的用量为10mL，每次30秒。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，每次的推荐用量为4mL。
- 经反复测试，洗涤3次，每次30秒，即可达到理想效果，但也可以根据实际情况每次酌情延长洗涤时间或增加洗涤次数。如果需要更多的Western洗涤液，推荐Western洗涤液或Western洗涤液(10X)。
- Anti-GFP Tag-HRP抗体工作液的配制。推荐抗体稀释比例为1:500，例如在5mL FastBlock封闭和抗体稀释液中加入10μL Anti-GFP Tag-HRP，即可得到5mL Anti-GFP Tag-HRP抗体工作液。
- 蛋白检测：
- BalbECL Star工作液的配制：混合0.5mL BalbECL Star A液和0.5mL BalbECL Star B液，配制成1mL BalbECL Star工作液，室温放置备用。工作液宜在临检测前配制。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，BalbECL Star工作液配制0.4mL即可。
- 用Western专用平头镊子将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜上。
- 滴加1mL BalbECL Star工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1分钟。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，BalbECL Star工作液的推荐用量为0.4mL。
- 通常放置1分钟就可以进行后续的成像或压片检测，但也可以根据实际情况酌情延长放置时间。如果需要更多的发光试剂，推荐BalbECL Star。
- 取膜，弃BalbECL Star工作液，用吸水纸略吸去过多的液体。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行化学发光成像仪检测或压片检测。
- BalbECL Star工作液的配制：混合0.5mL BalbECL Star A液和0.5mL BalbECL Star B液，配制成1mL BalbECL Star工作液，室温放置备用。工作液宜在临检测前配制。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，BalbECL Star工作液配制0.4mL即可。
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