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本试剂盒是基于SABC-AP信号放大系统而研制的用于免疫组化（IHC）、免疫细胞化学（ICC）、Western、Northern、Southern、EMSA等印迹（blotting）检测以及ELISA等基于生物素标记的各种高灵敏度检测。

组织、细胞、转移到膜上的或者结合于多孔细胞培养板上的抗原先与一抗结合，后者再与生物素标记的二抗结合；按照适当比例将Streptavidin和生物素标记的碱性磷酸酶（Biotin-AP）混合，形成网络状的SABC-AP复合物；接着二抗上标记的生物素再与SABC-AP结合，加入AP底物进行显色即可检测到相应的信号。其中Streptavidin和Biotin-AP混合后形成网络状复合物是信号能被放大的关键，相当于一个待检测的生物素分子通过SABC-AP复合物的识别最终可以由很多个AP分子来显示其信号，从而达到了信号放大的效果，参考下图。

• 本试剂盒检测灵敏度高。
  与常规的检测方法相比，由于本试剂盒采用了SABC信号放大系统，检测灵敏度显著提高，通常检测灵敏度比常规方法可以提高约5～10倍。常规方法检测信号过弱时，强烈推荐尝试本试剂盒。
  
• 本试剂盒特异性强、背景低。
  本试剂盒采用了比Avidin特异性更强、背景更低、灵敏度更高的Streptavidin。Streptavidin是从Streptomyces adidinii中纯化获得的一种分子量为66kD的四聚体蛋白，可以同时结合4个生物素分子，其对生物素的解离常数（Kd）可达10^-15M，比通常抗原抗体的亲和力高约100万倍，可以确保与生物素高度专一地结合。Streptavidin与鸡蛋清来源的Avidin （亲和素）在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性，但Streptavidin等电点几乎为中性（pI=6.0～6.5），其在中性条件下几乎不带电荷。而Avidin的pI=10.5，在中性条件下带正电荷。因此Streptavidin比Avidin的非特异性结合更低，检测灵敏度更高。

• 本试剂盒使用过程中所需的溶液不能含有碱性磷酸酶抑制剂，也不能加入可能含有生物素的溶液，如常规血清、脱脂奶粉、细胞培养液等，否则会降低本试剂盒的检测灵敏度。
  
• 任何与液体孵育有关的步骤都需要确保液体能很好地覆盖样品。样品没有被液体充分覆盖而最终出现发干的情况，会导致染色不能正常进行。
  
• 实验所需缓冲液宜新鲜配制。长期放置的缓冲液可能会因为微生物污染，而导致检测效果的下降。
  
• 本试剂盒中的两种试剂需配套使用，切勿与其它试剂混用。

• 参考表1配制SABC工作液
  表1.SABC工作液配制表
  

  用途	IHC/ICC	Blotting	ELISA
  SABC稀释液	10mL	10mL	10mL
  Streptavidin	100μL	100μ	20μL
  Biotin-AP	100μL	100μL	20μL
  按照上述比例依次加入各溶液，混匀后室温放置30min，即为SABC工作液。

  
  
  • 为确保充分形成Streptavidin-Biotin Complex，刚配制后必须室温至少放置30min后才能使用。
  • 配制好的SABC工作液必须在24h内使用完毕。
  • SABC稀释液：除ELISA检测外，推荐使用FastBlock免疫组化染色二抗稀释液或非荧光免疫染色二抗稀释液；ELISA检测推荐使用非荧光免疫染色二抗稀释液。通常宜选择有一定封闭能力的SABC稀释液，这样检测结果的背景通常会更低。
• 免疫组化染色（IHC）
  
  • 需用户自行准备的试剂
    
    • 洗涤液（推荐使用免疫染色洗涤液、10×免疫染色洗涤液）。
      
    • 固定液：4%多聚甲醛（推荐使用免疫染色固定液）。
      
    • 封闭液（推荐使用FastBlock免疫染色封闭液或免疫染色封闭液）。
      
    • 一抗。
      
    • 一抗稀释液（推荐使用FastBlock免疫染色一抗稀释液或免疫染色一抗稀释液）。
      
    • 二抗（推荐根据样品的种属特异性选购生物素标记山羊抗兔IgG、生物素标记山羊抗小鼠IgG等生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100）。
      
    • 二抗稀释液（推荐使用FastBlock免疫组化染色二抗稀释液或非荧光免疫染色二抗稀释液）。
      
    • BCIP/NBT显色液（推荐使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒）。
  • 染色方法
    
    • 按照常规方法制备石蜡或冰冻切片并灭活内源性碱性磷酸酶（推荐使用内源性碱性磷酸酶封闭液，需参考产品说明书将其加入到碱性磷酸酶底物溶液中进行封闭）。
      
    • 抗原的修复：根据不同的抗原和切片的种类，选择把切片放置在适当的抗原修复液中进行抗原修复(推荐使用柠檬酸钠抗原修复液、改进型柠檬酸钠抗原修复液、EDTA抗原修复液、EDTA柠檬酸钠抗原修复液、通用型强力抗原修复液、冰冻切片快速抗原修复液、漂片抗原修复液等相关抗原修复液)。
      
    • 洗涤液洗涤组织切片5min×4次。
      
    • 滴加封闭液封闭组织切片10～60min。使用FastBlock免疫染色封闭液仅需封闭10min，普通封闭液封闭60min。
      
    • 滴加一抗工作液，室温缓慢摇动孵育1h或静止孵育1～2h （为改善染色效果，可以4℃孵育过夜）。
      
    • 洗涤液洗涤组织切片5min×4次。
      
    • 滴加生物素标记二抗工作液，室温缓慢摇动孵育30～60min或静止孵育1-2h。孵育期间，参考表1配制SABC工作液，配制后应室温至少放置30min后才可以使用。
      
    • 用洗涤液洗涤组织切片5min×4次。
      
    • 滴加100μL的SABC工作液，室温缓慢摇动孵育30min或静止孵育1h。
      
    • 洗涤液洗涤组织切片5min×4次。
      
    • 滴加约100μL BCIP/NBT显色工作液，确保能充分覆盖样品。室温（约25℃）避光孵育约3～15min，至显色达到预期效果即可去除BCIP/NBT显色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次以终止显色反应。
• 免疫细胞化学染色（ICC）
  
  • 需用户自行准备的试剂
    
    • 洗涤液（推荐使用免疫染色洗涤液、10×免疫染色洗涤液）。
      
    • 固定液：4%多聚甲醛（推荐使用免疫染色固定液）。
      
    • 封闭液（推荐使用FastBlock免疫染色封闭液或免疫染色封闭液）。
      
    • 一抗。
      
    • 一抗稀释液（推荐使用FastBlock免疫染色一抗稀释液或免疫染色一抗稀释液）。
      
    • 二抗（推荐根据样品的种属特异性选购生物素标记山羊抗兔IgG、生物素标记山羊抗小鼠IgG等生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100）。
      
    • 二抗稀释液（推荐使用FastBlock免疫组化染色二抗稀释液或非荧光免疫染色二抗稀释液）。
      
    • BCIP/NBT显色液（推荐使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒）。
  • 染色方法（以6孔板为例）
    
    • 细胞固定：去除培养液，用PBS洗涤细胞1次。每孔加入1mL固定液。固定10min后去除固定液，用洗涤液洗涤3次。
      
    • 细胞打孔：如果上一步的洗涤使用的是免疫染色洗涤液）等或其它含有0.1% Triton X-100的洗涤液可以忽略本步骤。否则每孔加入1mL含0.1%的Triton X-100的适当洗涤液，室温静置5min后去除洗涤液。
      
    • 内源性碱性磷酸酶的灭活：按照常规方法灭活内源性碱性磷酸酶（推荐使用内源性碱性磷酸酶封闭液，需参考产品说明书将其加入到碱性磷酸酶底物溶液中进行封闭）。
      
    • 加入1mL封闭液，室温封闭10～60min。使用FastBlock免疫染色封闭液仅需封闭10min，普通封闭液封闭60min。
      
    • 去除封闭液，每孔加入0.5～1mL一抗工作液，室温缓慢摇动孵育1h或静止孵育1～2h （为改善染色效果，可以4℃孵育过夜）。
      
    • 每孔加入1mL洗涤液，室温缓慢摇动或静止放置洗涤5min×4次。
      
    • 吸尽洗涤液，每孔加入0.5～1mL生物素标记二抗工作液，室温缓慢摇动孵育30～60min或静止孵育1-2h。孵育期间，参考表1配制SABC工作液，配制后应室温至少放置30min后才可以使用。
      
    • 每孔加入1mL洗涤液，室温缓慢摇动或室温静止放置洗涤5min×4次。
      
    • 每孔加入500μL SABC工作液，室温孵育30min。
      
    • 每孔加入1mL洗涤液，室温缓慢摇动或室温静止放置洗涤5min×4次。
      
    • 每孔加入500μL BCIP/NBT工作液，室温（约25℃）避光孵育约3～15min，至显色达到预期效果即可去除BCIP/NBT显色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次以终止显色反应。显色期间，可以在显微镜下观察显色情况，以确定继续显色还是终止显色反应。
      
      图2.Hela细胞Tubulin免疫染色效果图。A.阴性对照组（不加一抗）。B.SABC-AP实验组。C.AP标记二抗对照组。
• Western Blot
  
  • 需用户自行准备的试剂
    
    • 封闭液（推荐使用FastBlock Western封闭液或Western封闭液）。
      
    • 洗涤液（推荐使用Western洗涤液/10×Western洗涤液）。
      
    • 一抗。
      
    • 一抗稀释液（推荐使用FastBlock Western一抗稀释液或Western一抗稀释液）。
      
    • 二抗（推荐根据样品的种属特异性选购生物素标记山羊抗兔IgG、生物素标记山羊抗小鼠IgG等生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100）。
      
    • 二抗稀释液（推荐使用FastBlock Western二抗稀释液或Western二抗稀释液）。
      
    • BCIP/NBT显色液（推荐使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒）。
  • 检测方法
    
    • SDS-PAGE电泳、转膜后，用封闭液室温缓慢摇动封闭10～60min。使用FastBlock Western封闭液仅需封闭10min，普通封闭液封闭60min。
      
    • 将膜置于一抗工作液中，室温缓慢摇动孵育1h （为提高检测敏感度，可以考虑4℃缓慢摇动孵育过夜）。
      
    • 洗涤液洗涤5min×4次。
      
    • 将膜置于生物素标记二抗工作液中，室温缓慢摇动孵育1h。孵育期间，参考表1配制SABC工作液，配制后应室温至少放置30min后才可以使用。
      
    • 洗涤液洗涤5min×4次。
      
    • 将膜置于SABC工作液中，室温缓慢摇动孵育30min。
      
    • 洗涤液洗涤5min×4次。
      
    • 如果进行BCIP/NBT显色：将膜置于适量的BCIP/NBT工作液中，一般室温避光孵育3～15min即可，去除BCIP/NBT显色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次即可终止显色反应；将膜自然风干后避光保存。BCIP/NBT显色的检测效果参考图3。
      
      图3.SABC法BCIP/NBT显色检测效果图。常规法采用AP标记二抗，SABC法采用本试剂盒。样品为Hela细胞总蛋白，上样量如图中所示。一抗是Tubulin抗体，稀释比例为1:1000。
      
      • SABC法可以达到普通ECL发光试剂的检测灵敏度。但除非条件所限，否则我们更推荐使用BalbECL Star化学发光试剂盒和HRP标记二抗进行Western检测。使用BalbECL Star检测时的灵敏度比用本试剂盒方法还要高约5倍或更多。
• ELISA
  
  • 需用户准备的试剂
    
    • 包被缓冲液：0.2M碳酸氢盐缓冲液，pH9.4。
      
    • 洗涤液：PBS(pH7.4)，0.05% Tween-20，0.1% BSA （推荐使用免疫染色洗涤液、10×免疫染色洗涤液）。
      
    • 封闭液：PBS,1% BSA （推荐使用FastBlock免疫染色封闭液或免疫染色封闭液）。
      
    • 抗原溶液：溶于包被缓冲液。
      
    • 一抗。
      
    • 一抗稀释液（推荐使用免疫染色一抗稀释液）。
      
    • 二抗（推荐根据样品的种属特异性选购生物素标记山羊抗兔IgG、生物素标记山羊抗小鼠IgG等生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100）。
      
    • 二抗稀释液（推荐使用FastBlock免疫组化染色二抗稀释液或非荧光免疫染色二抗稀释液）。
      
    • 酶反应底物：2mg/mL对硝基苯磷酸盐（p-nitropheny phosate,pNPP）溶于100mM NaHCO3,pH9.5,10mM MgCl₂。推荐使用碱性磷酸酶检测试剂盒）。
  • 检测方法（以96孔板为例）
    
    • 每孔中加入50～200μL的抗原溶液，室温孵育1h或4℃过夜。
      
    • 去除孔中液体并在吸水纸上拍干残余液体，每孔用200μL洗涤液洗涤3次，去除孔中的液体并在吸水纸上拍干。
      
    • 每孔加入200μL的封闭液室温孵育60min。
      
    • 去除孔中液体并在吸水纸上拍干残余液体，加入100μL的一抗工作液，室温孵育30min。
      
    • 每孔用200μL洗涤液洗涤3次，去除孔中的液体并在吸水纸上拍干残余液体。
      
    • 每孔加入100μL生物素标记二抗工作液，室温孵育30min （此时应配制SABC工作液，配制方法参考表1）。
      
    • 每孔用200μL洗涤液洗涤3次，然后加入200μL洗涤液孵育5min。
      
    • 去除孔中的液体并在吸水纸上拍干，每孔加入100μL SABC工作液，室温孵育30min。
      
    • 每孔用200μL洗涤液洗涤3次，然后加入200μL洗涤液孵育5min，去除孔中的液体并在吸水纸上拍干。
      
    • 每孔加入200μL酶反应底物（推荐使用碱性磷酸酶检测试剂盒），室温避光孵育3～30min或更长时间，直至显色至预期深浅，测定吸光度。可以根据实验需要考虑加入显色终止试剂，例如0.5M Na2CO3，并在400～415nm测定吸光度。

• 背景太深
  
  • 考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选择百奥莱博推荐的封闭液进行封闭。
    
  • 内源性蛋白结合的生物素，内源性凝集素以及离子间的相互作用都会使背景显色加深。针对内源性蛋白结合的生物素可采用生物素检测封闭液进行封闭，推荐使用SABC检测系统封闭试剂盒；对于内源性凝集素可在SABC稀释液中加入0.2M的ɑ-甲基甘露糖进行封闭；而对于离子间的相互作用带来的干扰，可以通过把SABC试剂溶于含有0.5M NaCl的缓冲液中来消除。
    
  • 对于免疫染色，需注意用适当方法灭活内源性碱性磷酸酶。
    
  • 考虑适当降低一抗或二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液或适当延长洗涤时间也会有所帮助。
• 没有信号或信号太弱
  
  • 评估样品中待检测的蛋白的表达水平是否足够高，最好能选择高表达的样品作为阳性对照。
    
  • 考虑适当提高一抗或二抗的浓度。
    
  • 适当延长显色或发光时间，另外须确定抗原修复对于所使用的一抗是否是必需或有效的。