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SABC-AP试剂盒图片
产品货号:
YTB4409
中文名称:
SABC-AP试剂盒
英文名称:
SABC-AP Kit(IHC, ICC, Blotting&ELISA)
产品规格:
1000T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本试剂盒是基于SABC-AP信号放大系统而研制的用于免疫组化(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、Western、Northern、Southern、EMSA等印迹(blotting)检测以及ELISA等基于生物素标记的各种高灵敏度检测。




组织、细胞、转移到膜上的或者结合于多孔细胞培养板上的抗原先与一抗结合,后者再与生物素标记的二抗结合;按照适当比例将Streptavidin和生物素标记的碱性磷酸酶(Biotin-AP)混合,形成网络状的SABC-AP复合物;接着二抗上标记的生物素再与SABC-AP结合,加入AP底物进行显色即可检测到相应的信号。其中Streptavidin和Biotin-AP混合后形成网络状复合物是信号能被放大的关键,相当于一个待检测的生物素分子通过SABC-AP复合物的识别最终可以由很多个AP分子来显示其信号,从而达到了信号放大的效果,参考下图。


SABC-AP试剂盒



  • 本试剂盒检测灵敏度高。
    与常规的检测方法相比,由于本试剂盒采用了SABC信号放大系统,检测灵敏度显著提高,通常检测灵敏度比常规方法可以提高约5~10倍。常规方法检测信号过弱时,强烈推荐尝试本试剂盒。
  • 本试剂盒特异性强、背景低。
    本试剂盒采用了比Avidin特异性更强、背景更低、灵敏度更高的Streptavidin。Streptavidin是从Streptomyces adidinii中纯化获得的一种分子量为66kD的四聚体蛋白,可以同时结合4个生物素分子,其对生物素的解离常数(Kd)可达10-15M,比通常抗原抗体的亲和力高约100万倍,可以确保与生物素高度专一地结合。Streptavidin与鸡蛋清来源的Avidin (亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性,但Streptavidin等电点几乎为中性(pI=6.0~6.5),其在中性条件下几乎不带电荷。而Avidin的pI=10.5,在中性条件下带正电荷。因此Streptavidin比Avidin的非特异性结合更低,检测灵敏度更高。



组分规格
Streptavidin1mL
Biotin-AP1mL

保存:-20℃,有效期1年。


  • 本试剂盒使用过程中所需的溶液不能含有碱性磷酸酶抑制剂,也不能加入可能含有生物素的溶液,如常规血清、脱脂奶粉、细胞培养液等,否则会降低本试剂盒的检测灵敏度。
  • 任何与液体孵育有关的步骤都需要确保液体能很好地覆盖样品。样品没有被液体充分覆盖而最终出现发干的情况,会导致染色不能正常进行。
  • 实验所需缓冲液宜新鲜配制。长期放置的缓冲液可能会因为微生物污染,而导致检测效果的下降。
  • 本试剂盒中的两种试剂需配套使用,切勿与其它试剂混用。



  • 参考表1配制SABC工作液
    表1.SABC工作液配制表
    用途IHC/ICCBlottingELISA
    SABC稀释液10mL10mL10mL
    Streptavidin100μL100μ20μL
    Biotin-AP100μL100μL20μL
    按照上述比例依次加入各溶液,混匀后室温放置30min,即为SABC工作液。

  • 免疫组化染色(IHC)
  • 免疫细胞化学染色(ICC)
    • 需用户自行准备的试剂
    • 染色方法(以6孔板为例)
      • 细胞固定:去除培养液,用PBS洗涤细胞1次。每孔加入1mL固定液。固定10min后去除固定液,用洗涤液洗涤3次。
      • 细胞打孔:如果上一步的洗涤使用的是免疫染色洗涤液)等或其它含有0.1% Triton X-100的洗涤液可以忽略本步骤。否则每孔加入1mL含0.1%的Triton X-100的适当洗涤液,室温静置5min后去除洗涤液。
      • 内源性碱性磷酸酶的灭活:按照常规方法灭活内源性碱性磷酸酶(推荐使用内源性碱性磷酸酶封闭液,需参考产品说明书将其加入到碱性磷酸酶底物溶液中进行封闭)。
      • 加入1mL封闭液,室温封闭10~60min。使用FastBlock免疫染色封闭液仅需封闭10min,普通封闭液封闭60min。
      • 去除封闭液,每孔加入0.5~1mL一抗工作液,室温缓慢摇动孵育1h或静止孵育1~2h (为改善染色效果,可以4℃孵育过夜)。
      • 每孔加入1mL洗涤液,室温缓慢摇动或静止放置洗涤5min×4次。
      • 吸尽洗涤液,每孔加入0.5~1mL生物素标记二抗工作液,室温缓慢摇动孵育30~60min或静止孵育1-2h。孵育期间,参考表1配制SABC工作液,配制后应室温至少放置30min后才可以使用。
      • 每孔加入1mL洗涤液,室温缓慢摇动或室温静止放置洗涤5min×4次。
      • 每孔加入500μL SABC工作液,室温孵育30min。
      • 每孔加入1mL洗涤液,室温缓慢摇动或室温静止放置洗涤5min×4次。
      • 每孔加入500μL BCIP/NBT工作液,室温(约25℃)避光孵育约3~15min,至显色达到预期效果即可去除BCIP/NBT显色工作液,用蒸馏水洗涤1~2次以终止显色反应。显色期间,可以在显微镜下观察显色情况,以确定继续显色还是终止显色反应。
        SABC-AP试剂盒
        图2.Hela细胞Tubulin免疫染色效果图。A.阴性对照组(不加一抗)。B.SABC-AP实验组。C.AP标记二抗对照组。
  • Western Blot
    • 需用户自行准备的试剂
    • 检测方法
      • SDS-PAGE电泳、转膜后,用封闭液室温缓慢摇动封闭10~60min。使用FastBlock Western封闭液仅需封闭10min,普通封闭液封闭60min。
      • 将膜置于一抗工作液中,室温缓慢摇动孵育1h (为提高检测敏感度,可以考虑4℃缓慢摇动孵育过夜)。
      • 洗涤液洗涤5min×4次。
      • 将膜置于生物素标记二抗工作液中,室温缓慢摇动孵育1h。孵育期间,参考表1配制SABC工作液,配制后应室温至少放置30min后才可以使用。
      • 洗涤液洗涤5min×4次。
      • 将膜置于SABC工作液中,室温缓慢摇动孵育30min。
      • 洗涤液洗涤5min×4次。
      • 如果进行BCIP/NBT显色:将膜置于适量的BCIP/NBT工作液中,一般室温避光孵育3~15min即可,去除BCIP/NBT显色工作液,用蒸馏水洗涤1~2次即可终止显色反应;将膜自然风干后避光保存。BCIP/NBT显色的检测效果参考图3。
        SABC-AP试剂盒
        图3.SABC法BCIP/NBT显色检测效果图。常规法采用AP标记二抗,SABC法采用本试剂盒。样品为Hela细胞总蛋白,上样量如图中所示。一抗是Tubulin抗体,稀释比例为1:1000。
        • SABC法可以达到普通ECL发光试剂的检测灵敏度。但除非条件所限,否则我们更推荐使用BalbECL Star化学发光试剂盒和HRP标记二抗进行Western检测。使用BalbECL Star检测时的灵敏度比用本试剂盒方法还要高约5倍或更多。
  • ELISA
    • 需用户准备的试剂
    • 检测方法(以96孔板为例)
      • 每孔中加入50~200μL的抗原溶液,室温孵育1h或4℃过夜。
      • 去除孔中液体并在吸水纸上拍干残余液体,每孔用200μL洗涤液洗涤3次,去除孔中的液体并在吸水纸上拍干。
      • 每孔加入200μL的封闭液室温孵育60min。
      • 去除孔中液体并在吸水纸上拍干残余液体,加入100μL的一抗工作液,室温孵育30min。
      • 每孔用200μL洗涤液洗涤3次,去除孔中的液体并在吸水纸上拍干残余液体。
      • 每孔加入100μL生物素标记二抗工作液,室温孵育30min (此时应配制SABC工作液,配制方法参考表1)。
      • 每孔用200μL洗涤液洗涤3次,然后加入200μL洗涤液孵育5min。
      • 去除孔中的液体并在吸水纸上拍干,每孔加入100μL SABC工作液,室温孵育30min。
      • 每孔用200μL洗涤液洗涤3次,然后加入200μL洗涤液孵育5min,去除孔中的液体并在吸水纸上拍干。
      • 每孔加入200μL酶反应底物(推荐使用碱性磷酸酶检测试剂盒),室温避光孵育3~30min或更长时间,直至显色至预期深浅,测定吸光度。可以根据实验需要考虑加入显色终止试剂,例如0.5M Na2CO3,并在400~415nm测定吸光度。



  • 背景太深
    • 考虑使用适当的封闭液进行封闭,例如选择百奥莱博推荐的封闭液进行封闭。
    • 内源性蛋白结合的生物素,内源性凝集素以及离子间的相互作用都会使背景显色加深。针对内源性蛋白结合的生物素可采用生物素检测封闭液进行封闭,推荐使用SABC检测系统封闭试剂盒;对于内源性凝集素可在SABC稀释液中加入0.2M的ɑ-甲基甘露糖进行封闭;而对于离子间的相互作用带来的干扰,可以通过把SABC试剂溶于含有0.5M NaCl的缓冲液中来消除。
    • 对于免疫染色,需注意用适当方法灭活内源性碱性磷酸酶。
    • 考虑适当降低一抗或二抗浓度。另外,选择适当强度的洗涤液或适当延长洗涤时间也会有所帮助。
  • 没有信号或信号太弱
    • 评估样品中待检测的蛋白的表达水平是否足够高,最好能选择高表达的样品作为阳性对照。
    • 考虑适当提高一抗或二抗的浓度。
    • 适当延长显色或发光时间,另外须确定抗原修复对于所使用的一抗是否是必需或有效的。

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