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本制品是一种基于WST系列生色底物用于3D细胞活力、增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。本试剂盒适用于在450nm左右测定吸光度，通常约1小时即可完成检测。

本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

随着3D细胞培养技术的日益成熟，3D细胞培养技术已经成为非常常用的研究工具，也越来越受欢迎，在基础研究和药物发现等中的应用越来越广泛，而3D培养条件下的细胞活性检测也成为一大难点。

WST系列生色底物，例如WST-1、WST-8等，是一系列类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。本试剂盒经过多方面的反复优化，通过测定formazan的吸光度就可以非常高效、线性、准确地测定3D细胞球的总体细胞活力。

• 本试剂盒检测非常便捷。试剂盒仅一管已经配制好的CCK-3D溶液，无须再进行任何配制等操作。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解formazan。可以用于大批量样品的检测。
  
• 本试剂盒耐受性好。酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。
  
• 本制品对细胞无明显毒性。加入CCK-3D溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。
  
• 本制品不仅适合少量样品的检测，也非常适合大量样品的高通量筛选检测。可用于各种培养方法培养出的含细胞培养液的3D细胞球，包括细胞悬滴培养板、超低吸附细胞培养板、琼脂糖包被的平板等。

组分	100T	500T	2500T
CCK-3D溶液	1mL	5mL	25mL
说明书	1份

保存：-20℃，避光，有效期1年。

• 本试剂盒反复冻融会降低检测效果。尽管经测试本试剂反复冻融3次对于其检测效果无显著影响，为取得良好的使用效果，第一次解冻后可适当分装保存。反复冻融过程中，可能会出现少量沉淀，此时宜平衡至室温，并尽量溶解。
  
• 温度的高低会影响信号强度和信号稳定性，反应前细胞和CCK-3D溶液均需平衡至室温后再进行测定，可将CCK-3D溶液在不超过25℃的室温或20～25℃的水浴中融解并混匀后使用。
  
• 由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
  
• 3D细胞在96孔板中一般成球状体存在，加入CCK-3D溶液后形成的橙黄色formazan也聚集在细胞球上及周边，检测前需要轻轻拍动96孔板使formazan均匀分布于细胞培养液中，否则测定的信号值可能会偏差，从而影响检测结果的准确性。
  
• 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。
  
• 检测时仅需使用普通透明的96孔板或384孔板。也可使用专为3D培养的超低吸附培养皿或多孔板培养好3D细胞后，转移至普通透明的多孔板中进行检测。百奥莱博提供各种超低吸附培养皿或多孔板，详见相关产品。
  
• 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。
  
• 我公司提供3D细胞活力检测试剂盒(发光法)，该试剂盒是通过化学发光法测定细胞内ATP含量从而用于超高灵敏度、高信号稳定性定量检测3D培养细胞总体活性。

本试剂盒用于3D培养的HCT-116和MOLM-13细胞活性检测效果参见图1。

图1.本试剂盒对不同数量MOLM-13和HCT-116细胞在3D细胞培养48小时后的检测效果图。不同数量的HCT-116和MOLM-13细胞100μL每孔接种于康宁球体微孔板进行3D培养，培养48小时后每孔各加入本制品10μL，孵育1小时后测定A450，在1万个细胞内信号强度与细胞数之间的线性较好，细胞数量超过1万、或者孵育时间超过1小时后可能会不呈现线性关系，但信号值还是会继续升高。实测数据会因具体实验条件的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• 对于96孔板，通常细胞增殖实验每孔加入100μL 2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μL 5000个细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照，按照3D细胞培养方案培养细胞。如有需要，可加入药物处理细胞。
  
• 每孔加入10μL CCK-3D溶液。如果起始的培养体积为200μL，则需加入20μL CCK-3D溶液，其它情况以此类推。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-3D溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
  
• 在细胞培养箱内继续孵育0.5～3小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、1.5、2和3小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
  
• 轻轻拍动96孔板、混匀孔内橙黄色的formazan，在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420～480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

• CCK-3D溶液对细胞的毒性大小如何？
  CCK-3D溶液对细胞的毒性非常低，通常观察不到细胞毒性。细胞在CCK-3D法检测后仍然可以正常生长，并可以用于其它的细胞实验。但为了避免CCK-3D溶液可能带来的对于后续检测的影响，除非该细胞极难获得，否则不推荐把CCK-3D溶液孵育过的细胞用于其它实验。
  
• 如果吸光度值太低，可以采取什么办法？
  
  • 适当增加细胞数量。
    
  • 延长加入CCK-3D溶液后的孵育时间。

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