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本试剂盒基于T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)的激酶活性，可用于催化磷酸基团从ATP转移至单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基，实现5'端磷酸化修饰；同时可以基于T4 PNK的磷酸酯酶活性，可用于催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸的3'磷酸的脱磷酸基团的反应。

进行寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端连接；去除3'端磷酸基团。


T4 PNK中文名称T4多聚核苷酸激酶，是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其它NTP也可产生相同的反应：
5'-OH + NTP → 5'-P + NDP
这个磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4 Polynucleotide Kinase可以显示出5'磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其它NTP也可产生相同的反应：
5'-P + NDP → 5'-OH + NTP (最适pH为6.4左右)
当ATP和ADP都适量存在时，T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其它NTP也可产生相同的反应：
5'-P + NTP + NDP → 5'-P + NDP + NTP
T4 Polynucleotide Kinase同时具有3'磷酸酯酶活性，可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：
3'-P → 3'-OH + Pi (最适pH为5.9左右)
T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在N-末端附近，而磷酸酯酶活性在C-末端附近。


本试剂盒催化线性双链DNA的5'羟基末端磷酸化和3'磷酸末端去磷酸化的示意图请参考图1。

图1．本试剂盒催化线性双链DNA的5'羟基末端磷酸化和3'磷酸末端去磷酸化的反应示意图。本试剂盒可以催化5'羟基的磷酸化(5'多聚核苷酸激酶反应)和3'磷酸转变为3'羟基(3'磷酸酯酶反应)共2个常见的反应。蓝色线条部分代表DNA序列。


本试剂盒催化线性双链DNA (Linear double-strand DNA)的5'羟基末端磷酸化的效果请参考图2。

图2．本试剂盒催化线性双链DNA的5'羟基末端磷酸化的效果图。25μL反应体系(磷酸化反应)：20pmol 38bp dsDNA,1X T4 PNK Buffer,1μL T4 PNK Enzyme，37℃孵育30分钟进行磷酸化反应。λ核酸外切酶(货号：YTB4115)能够高效催化5'磷酸化的双链DNA分子的降解，对非磷酸化修饰的双链DNA和单链DNA则几乎不能酶切，Lambda Exonuclease对底物的消化程度越高，说明本试剂盒对dsDNA的磷酸化越完全。20μL反应体系(λ核酸外切酶消化反应)：3.2pmol磷酸化底物，67mM Glycine-KOH,2.5mM MgCl₂,50μg/mL BSA (pH9.4@25℃),1.25U λ核酸外切酶，37℃孵育5分钟或30分钟，70℃孵育10分钟终止反应，加入6×DNA上样缓冲液(货号：YT418)，取6μL进行Native-PAGE (15%)电泳分析，最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示，本制品对线性双链DNA的5'羟基末端具有良好的磷酸化效果。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

组分	50T	200T
T4 PNK	50μL	200μL
10×T4 PNK Buffer	200μL	800μL

保存：-20℃，有效期1年。

• 本试剂盒提供的10×T4 PNK Buffer中已经包含了ATP，无需再额外添加。
  
• PCR产物需要适当纯化后再用本制品进行5'磷酸化。
  
• 限制性内切酶消化产生的DNA很多情况下可以不经过纯化步骤，直接进行5'磷酸化和3'去磷酸化反应。虽然反应效率可能会有一定差异，但不会影响平端克隆。如果用于高通量测序建库，需要酌情考虑是否需要纯化后再进行后续反应。
  
• 本试剂盒中的buffer可以很好地兼容T4 DNA ligase。如果后续用于T4 DNA ligase的连接反应，无需进行纯化以去除buffer。

• DNA、RNA或寡核苷酸的5'磷酸化和3'去磷酸化反应。
  
  • 参考下表，在冰浴上设置反应体系。
    

    成分	用量	终浓度
    Nuclease-Free Water	(21.5-x)μL	-
    Substrate	x μL	0.8μM
    10×T4 PNK Buffer	2.5μL	1×
    T4 PNK	1μL	-
    总量	25μL	-

    • 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
      
    • 如果同时进行多个反应，可以把上表中除底物(Substrate)之外的所有溶液和酶预混合，然后再分装到各反应管。
  • 反应条件：37℃孵育30分钟。
    
  • 终止反应：加入1μL 0.5M EDTA (pH8.0)并混匀以终止反应。
    
  • 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化反应产物，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化，推荐使用PCR产物DNA纯化试剂盒(货号：YT009)或BalbMag磁珠法PCR产物DNA纯化试剂盒(货号：YTB4120)。
• 其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。

相关搜索：T4多聚核苷酸激酶试剂盒，T4 PNK，T4 Polynucleotide Kinase Kit