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本产品是一种仅需加入RNA模板和水就能进行反转录的最简单、便捷、快速、稳定并且非常高效的cDNA第一链合成产品。本产品对于3kb以下片段，10min就能完成反转录；产物长度可以长达12kb；可以在55℃进行高温反转录，有效解决复杂二级结构RNA反转录难的问题；-20℃不会结冻，取用非常便捷。BalbRT III cDNA第一链合成预混液(5X)包含了经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的BalbRT III M-MLV反转录酶、RNase Inhibitor、Oligo(dT)18 Primer、Random Hexamer Primer、dNTPs、MgCl₂和反转录反应缓冲液，只需加入RNA模板和水(DEPC-treated Water或DNase/RNase-Free Water)就能进行反转录反应，大大简化了反转录的实验操作，使操作最为便捷，能有效避免常规反转录非常复杂的操作过程中可能导致的操作误差、孔间污染等，使反转录的重复性和平行性大幅提升。

本产品可广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成，后续可以用于PCR、real-time PCR也称定量PCR (qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建，尤其是反转录所得目的基因的克隆等。BalbRT III cDNA第一链合成预混液(5X)还可以通过反转录用于DNA探针的荧光、生物素、地高辛或同位素标记等，也可以通过引物延伸来分析和研究RNA。

BalbRT III cDNA第一链合成预混液(5X)中的BalbRT III M-MLV反转录酶，是一种经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的M-MLV反转录酶，具有正常的依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性，能够以RNA或DNA为模板，在引物存在的情况下进行互补DNA链的合成，即可以进行cDNA的第一链合成，同时它保留了RNase H的活力，能选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，有利于后续cDNA第二链的合成。

如果希望进行常规的反转录操作，可以单独选购BalbRT III M-MLV反转录酶(YTB3010),RNase Inhibitor (YT530)和dNTP mix (YT391)，或者选购BalbRT III cDNA第一链合成试剂盒(YTB3011)进行反转录反应。

• 本产品经测试可以轻松完成长度为8kb及以下基因的反转录，反转录的最大长度可以达到12kb。BalbRT III M-MLV反转录酶热稳定性好，反转录效率高。本产品最适反应温度为42℃，当温度达到50℃时仍具有很高活性，对于长度较短的cDNA反转录，温度达到55℃时也可获得较高产量的cDNA。高温反转录对于高GC含量RNA的反转录，能有效减少二级结构，提升反转录效率。反转录速度快，6kb以下的cDNA反转录只需0.5h即可完成，3kb以下的cDNA反转录10min即可完成。
  
• 本产品反转录效率高，BalbRT III cDNA第一链合成预混液(5X)的反转录效率与非预混液的反转录效率一致(参考图1)。
  
  图1．使用百奥莱博的BalbRT III cDNA第一链合成预混液(5X)和使用BalbRT III M-MLV反转录酶的常规反转录体系的效果对比图。在20μL的反转录反应体系中，以HEK293T细胞中提取的1μg总RNA为模板，没有加入反转录酶、分别使用BalbRT III M-MLV反转录酶的常规反转录体系和BalbRT III cDNA第一链合成预混液(5X)，42℃反转录60min。然后取1μL反转录产物分别进行两个目的基因(2.6kb的YWHAZ基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR扩增和电泳检测。
  
• 本产品操作便捷，作为即用型第一链合成预混液(5X)，即反转录预混液(5X)，只需加入模板RNA和水，即可快速进行反转录反应，并且BalbRT III cDNA第一链合成预混液(5X)在-20℃不会结冻，使用非常便捷。
  
• 本产品重复性好，反转录所有试剂预混合，大大减少操作步骤，有效降低污染几率和操作误差，使实验结果更加一致，重复性更好。

• 由于本预混液(5X)含有适量甘油，使用时须注意与RNA样品及水充分混匀，否则可能会导致反转录不充分。
  
• 对于GC含量比较高的RNA的反转录，产品的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。
  
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• cDNA第一条链的合成(First-stand cDNA Synthesis)：
  
  • 参考如下表格中设置的20μL反转录体系：
    

    RNA	Total RNA	0.1ng～5μg
    	或poly(A) RNA/mRNA	10pg～0.5μg
    	或specific RNA	0.01pg～0.5μg
    DEPC-treated Water	－	To 16μL*
    选择性步骤：如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构，混匀后微离心以把液体沉降至管底，65℃孵育5min，随后立即置于冰上冷却，以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。
    BalbRT III cDNA第一链合成预混液(5X)	－	4μL
    总体积	－	20μL

    
    
  • 混匀反应体系(用移液器轻轻吹打数次以充分混匀或用涡旋混合器在较低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
    注：本预混液(5X)含有适量甘油，使用时须注意与RNA样品及水充分混匀，否则可能会导致反转录不充分。
    
  • 42℃孵育10～60min。反转录3kb以下的cDNA，反转录10min即可，反转录3～6kb的cDNA，反转录30min即可，而6kb以上的cDNA推荐反转录60min。后续用于qPCR时，检测任何长度的基因，通常反转录10min就足够了。
    注意：对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA，可以50℃反转录60min，以充分利用本产品反转录酶在50℃时仍有良好的反转录酶活性这一特点，在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
    
  • 80℃孵育10min以失活反转录酶并终止反转录反应。说明：对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪切，此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
    
  • 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为20μL和50μL，则推荐相应地使用0.8μL和2μL反转录产物。
• 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶的相关文献资料进行。

• 总RNA反转录产物电泳观察不到。
  
  • 反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
• 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
  
  • PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
    
  • 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
    
  • 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用百奥莱博的BalbZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
    
  • 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
    
  • 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45～55℃。
    
  • BalbRT III cDNA第一链合成预混液(5X)没有与RNA样品及水充分混匀。