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本试剂盒是一种高效、稳定、快速并可以去除基因组DNA污染的反转录系统。本试剂盒含有高效去除基因组DNA的gDNase；通过42℃，3min即可去除gDNA，有效避免Total RNA中基因组DNA的干扰。本试剂盒所含的高效反转录酶Quicking RT Enzyme，是通过分子改造后的新型反转录酶，特别增加了疏水motif，具有更强的RNA亲和性和热稳定性，从而进一步提高了其反转录效率和反应速率，42℃、15min即可完成cDNA第一链的合成。另外，由于新型酶与RNA亲和力的增强，使其在通读GC含量高，二级结构复杂的RNA模板和抗逆性等方面的表现也更为的突出。

• 反转录效率高：反转录效率可达95%以上；
  
• 操作简单快速：反应体系配制简单，21min完成cDNA第一链的合成；
  
• 通读复杂模板：能够作用于GC含量高，二级结构复杂的RNA模板；
  
• 样品普适性高：对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高；
  
• 后续兼容性好：后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。

RT-PCR；荧光定量RT-PCR；cDNA文库构建；SAGE（基因表达连续分析）；引物延伸。



图1．使用本试剂盒及国外A公司同类产品（右）反转录小鼠RNA，使用我公司Real-Time PCR预混反应液(货号：WH0103)进行定量MM5基因，展示扩增曲线和熔解曲线。RNA使用量分别为1000ng，100ng，10ng，1ng。结果显示，本试剂盒反转录梯度清晰，Ct值靠前，并且对于低丰度模板（1ng，蓝色箭头）的反转录具有明显优势。

图2．使用本试剂盒及A公司同类产品分别反转录大鼠的正常RNA样本（红色），酚类残留量大的RNA样本（绿色），和醇类残留量大的RNA样本（蓝色），使用我公司Real-Time PCR预混反应液(货号：WH0103)进行定量RNC基因，展示扩增曲线和平均Ct值。结果显示，本试剂盒反转录后定量Ct值靠前，并且抗逆性优秀，对于高杂质残留的模板具有明显优势。

组分	25T	100T	1000T
5×gDNA Buffer	50μL	200μL	10×200μL
FQ-RT Primer Mix	50μL	200μL	10×200μL
Quicking RT Enzyme Mix	25μL	100μL	10×100μL
10×King RT Buffer	50μL	200μL	10×200μL
RNase-Free ddH2O	1mL	2×1mL	10×2×1mL

保存：-20℃，有效期一年。

• 下列操作步骤适用于模板量为50ng～2μg的总RNA，如果总RNA量大于2μg，请按比例扩大反应体系。
  
• 在冰上进行操作，防止RNA发生降解。
  
• 不需分开变性和退火两个步骤。但是对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步骤，即在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5min后迅速转移到冰上，进行下一步操作。
  
• 根据实验需求不同，也可以选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，引物使用量如下：
  Oligo-dT Primer 50pmol/20μL反应体系，Gene Specific Primer 5pmol/20μL反应体系。
  
• 使用Gene Specific Primer时，反转录反应可设置为42℃，15min。当PCR反应有非特异性扩增时，将反转录温度升到50℃会有改善。
  
• 反转录体系可以根据需要相应扩大。

使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA 50ng～2μg总RNA可建立20μL反应体系。

• 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温（15～25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
  以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
  
• 按下表的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
  

  成分	用量
  5×gDNA Buffer	2μL
  Total RNA	-
  RNase-Free ddH2O	至10μL

• 按下表的反转录反应体系配制混合液。
  

  成分	用量
  10×King RT Buffer	2μL
  Quicking RT Enzyme Mix	1μL
  FQ-RT Primer Mix	2μL
  RNase-Free ddH2O	至10μL

• 将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。
  
• 42℃，孵育15min。
  
• 95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。
  
  • 若后续实验为实时荧光定量PCR，逆转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10，例如50μL的PCR反应体系，逆转录产物的加量应不超过5μL。
    
  • 将逆转录产物置于冰上，再进行后续PCR反应；如果需要长时间保存，请置于-20℃。

对RNA模板的要求：
逆转录酶以RNA为模板合成第一链cDNA，模板RNA的质量和数量直接影响逆转录的结果。

• 模板的完整性：模板RNA的完整性对逆转录非常重要，若RNA模板中含有RNase酶将降解模板RNA，最后导致cDNA产物的量少甚至无cDNA产物。
  
• 模板的纯度：若RNA模板中含有蛋白、盐离子、EDTA、乙醇、酚等杂质，将影响逆转录酶的活性，最后影响逆转录结果。
  
• 模板的加量：以下操作步骤适用于模板RNA量为50ng～2μg，如果模板RNA的量大于2μg，请按比例扩大反应体系。

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