产品货号:
WH0099
中文名称:
cDNA第一链合成试剂盒
英文名称:
BaiScript II RT Kit
产品规格:
25次|100次
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒适用于二级结构复杂和长链cDNA合成。提供了所有的用于cDNA第一链合成的试剂,其中的BaiScriptⅡ RTase为改良后的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV),改良后的新RTase具有更高的模板亲和力和更低的RNase H活性,因此使其在cDNA第一条链的合成过程中具有通读复杂二级结构模板和反转录长片段cDNA的能力。产品中配备的5×BaiScriptⅡ RTase Buffer经过精心的优化,既保证了新型RTase的高效酶活,又拓宽了RNA模板量的加入范围,使得反转录出来的cDNA具有更好的质量以便用于后续的实验分析。
- 酶活效率高:高效的反转录酶活性,后续实验兼容性好。
- 底物范围广:适用于所有RNA,尤其是具有复杂二级结构的RNA模板。
- 反转片段长:cDNA第一链合成可以达到12kb。
- cDNA第一链的合成;
- cDNA文库的构建;
- 一步法RT-PCR;
- RACE分析。
本试剂盒对不同长度片段的反转录能力
实验材料:人类贴壁细胞总RNA。RT-PCR起始量:20μL反转录产物(50ng/μl)
实验结果:以上为1μg总RNA反转录后取2μL反转录产物进行10个长度不同的目标基因的扩增图
扩增体系:20μL
上样量:5μL
电泳条件:6V/cm,20min
各泳道图示:
1:产物长度120bp;2:产物长度1.0kb
3:产物长度2.5kb;4:产物长度3.2kb
5:产物长度4.6kb;6:产物长度6.8kb
7:产物长度7.6kb;8:产物长度8.9kb
9:产物长度10kb;9:产物长度12kb
组分 | 25次 | 100次 |
BaiScript II RTase (200U/μl) | 25μL | 100μL |
Oligo (dT)15(10μM) | 60μL | 240μL |
Random (10μM) | 60μL | 240μL |
5×BaiScript II RTase Buffer | 150μL | 500μL |
RNase-free ddH2O | 1mL | 2×1mL |
Super Pure dNTPs (10mM,each) | 30μL | 120μL |
RNasin (40U/μl) | 15μL | 2×30μL |
保存:-20℃,有效期一年。
- 用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行滤除菌处理。
- RNA样品要避免基因组DNA污染;
- 避免反复冻融RNA,使RNA保持在冰浴中处融化状态;
- 试剂盒中各组分成分应在-20℃保存;
- 在使用Random Primer时,要注意随机引物量和总RNA量之间的关系,一般建议50ng随机引物/5μg总RNA。当提高Random/RNA的比率将会提高短片段(~500bp)cDNA的合成;而当降低Random/RNA的比率将会提高长片段cDNA的合成;
- 如果模板RNA富含二级结构,可以先在65℃条件下处理5min;
- 如果反转录中使用PCR下游引物,为了防止引物错配导致的非特异扩增,可以在50℃条件下进行反转录;
- 在进行长片段扩增时,为了防止cDNA结果被破坏,建议以70℃下处理15min为酶灭活条件;
- 当使用酶类时,应轻轻混匀,避免起泡;分取之前要小心地离心收集到反应管底部,由于酶粘度高,吸取时应慢慢吸取。
- 如果要扩增长片段,需使用新鲜提取所得的完整性好、纯度高的RNA。
- 将模板RNA在冰上解冻;引物、5×BaiScriptⅡRTase Buffer、Super Pure dNTPs混合液和RNase-free ddH2O在室温(15~25℃)条件下解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体。
- 按照下表的体系在冰浴的无核酸酶的离心管中配制混合液:
表1:gDNA去除反应体系成分 用量 RNA 1ng~2μg Total RNA
或1pg~2ng Poly(A) mRNAPrimer 2μL Oligo-dT(10μM)
或2μL Random Primer(10μM)
或10~15 pmole基因特异性引物Super Pure dNTPs (10mM) 1μL RNase-free H2O 补充至14.5μL - 65℃孵育5min,然后置于冰上2min。
- 在上述反应液的基础上继续加入下表所列的反转录组分:
成分 用量 上述反应液 14.5μL 5×BaiScript II RTase Buffer 4μL RNasin (40U/μl) 0.5μL BaiScript II RTase(200U/μl) 1μL - 如果引物为Random Primer则需将体系现在25℃下孵育10min,如果引物为Oligo-dT和基因特异性引物则不需要此步骤。
- 42℃孵育60min。
- 85℃加热5min(或70℃加热15min)终止反应,置于冰上进行后续实验或冷冻保存。
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