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本试剂盒提供了DNA文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液，包含除接头与PCR引物外的所有成分，用于illumina二代测序平台DNA文库构建。和一般建库方法相比，该试剂盒操作简单、方便，极大地缩短了文库构建时间。另外，试剂盒采用高保真DNA聚合酶进行文库富集，无偏好的PCR扩增，扩大了序列的覆盖区域，可高效制备用于illumina二代测序平台的DNA文库。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性。

• 末端补平，磷酸化，加A一步完成。
  
• 不需纯化，直接加接头。
  
• 超保真扩增，最大程度上降低了扩增偏好性。
  
• 支持多种样本，且所得文库能够用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq 2500/2000/1000和MiSeq sequencing等测序平台的测序。

组分	24次	96次
End Prep Enzyme Mix	48μL	192μL
10x End Repair Reaction Buffer	200μL	800μL
T4 DNA ligase	48μL	192μL
T4 DNA ligase Buffer	400μL	2×800μL
HiFidelity 2×PCRMasterMix	600μL	2×1.2mL

• 磁力架
  
• DNA纯化回收试剂盒：建议使用百奥莱博DNA纯化回收试剂盒(磁珠法)(货号：WE0205)。
  
• 样本接头引物试剂盒：建议使用百奥莱博二代测序接头引物试剂盒(Illumina平台Index Primer1-12)(货号：WE0241)/二代测序接头引物试剂盒(Illumina平台Index Primer13-24)(货号：WE0240)。
  
• 无水乙醇，EB(10mM Tris-HCl,pH8.0)，去离子水(pH在7.0～8.0之间)。
  
• 反应管：建议使用低吸附的PCR管与1.5mL离心管；枪头：建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染。

• 避免试剂的反复冻融，建议您首次使用试剂盒后将剩余试剂分装保存。
  
• PCR产物因操作不当极易产生污染，导致实验结果不准确，建议将PCR反应体系配制区与PCR产物纯化区隔离，并使用专门的移液器，定时对各实验区域进行清洁。

DNA建库流程示意图：






5ng～1μg打断的双链DNA，溶于EB（10mM Tris-HCl pH8.0)或去离子水中。DNA纯度要求：OD260/OD280=1.8~2.0。

DNA末端修复反应：

• 向200μL PCR管中加入以下试剂：
  

  成分	用量
  10×End Repair Reaction Buffer	6.5μL
  End Prep Enzyme Mix	2μL
  fragmented DNA	X(5ng～1μg)
  RNase-free Water	至65μL

  
  
• 用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底。
  
• 将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：

  温度	时间
  15min	12℃
  15min	37℃
  20min	72℃

Adaptor连接：
建议使用百奥莱博adaptor进行连接，也可选择使用NEB、illumina公司的adaptor，具体连接方法可参考各公司的产品使用说明书。以下为使用百奥莱博adaptor进行连接的

• 向上述已完成DNA末端修复的反应液中直接加入以下试剂：
  

  成分	用量
  T4 DNA ligase buffer for illumina	14μL
  T4 DNA ligase	2μL
  Adaptor	2.5μL

  
  此时管中溶液总体积为83.5μL。
  注意：若起始样本量少于100ng，请将adaptor用去离子水稀释10倍至1.5μM后使用。
  
• 用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。
  
• 20℃温浴15分钟。
  注意：若此操作使用pcr仪，请将热盖关闭。

DNA片段的选择性回收
建议使用百奥莱博DNA纯化回收试剂盒(磁珠法)(货号：WE0205)进行DNA片段选择性回收。
注意：DNA片段选择性回收是可选步骤，若起始样本量低于50ng，不建议进行DNA片段选择性回收，可参考说明书第4页，直接进行DNA片段的纯化。另外构建不同大小的DNA文库时，DNA片段选择性回收的磁珠使用量不同，具体磁珠用量可参照附表1（若使用除我司以外厂家的磁珠，需自行摸索最佳磁珠用量）。
以下操作步骤中，可选择回收DNA片段长度峰值为320bp（插入片段长度200bp），反应起始体积为100μL。

• 涡旋振荡MagPure 20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
  
• 向连接反应液中加入16.5μL去离子水，使adaptor连接反应缓冲液体积至100μL。
  注意：若使用NEB adaptor，只需要加入13.5μL去离子水。
  
• 将上述adaptor反应缓冲液转移至一新的1.5mL离心管中。
  
• 加入70μL混合均匀的MagPure，涡旋震荡5秒钟后，室温静置5分钟。
  
• 短暂离心，将离心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5分钟），小心地将上清溶液转移至新的1.5mL离心管中，并弃去磁珠。
  注意：不要弃除上清。
  
• 向上清中加入25μL混合均匀的MagPure，涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟。
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5分钟），小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
  注意：不要弃除磁珠。
  
• 继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μL新配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
  
• 重复步骤8。
  
• 保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
  
• 将离心管从磁力架上取下，加入28μL 10mM Tris-HCl（pH8.0）或去离子水（自备），涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将23μL洗脱液转移至一个新的PCR管中；
  注意：一定不要转移磁珠，微量磁珠污染可影响后续PCR反应的正常进行。

另一种方案：DNA片段的纯化

• 涡旋振荡MagPure 20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
  
• 将adaptor连接反应液转移至一新的1.5mL离心管中。
  
• 加入1倍样品体积的MagPure，涡旋震荡5秒钟后，室温静置5分钟。
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5分钟），小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
  注意：不要弃除磁珠。
  
• 继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μL新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
  
• 重复步骤5。
  
• 保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
  
• 将离心管从磁力架上取下，加入28μL EB（自备）或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将23μL洗脱液转移至一个新的PCR管中。

PCR扩增
1．在PCR管中加入以下试剂并混匀。

成分	用量
连接adaptor后的DNA片段	23μL
2×HiFidelity PCR Mix	25μL
Univesial primer	1μL
Index primer	1μL
总体积	50μL

2．PCR反应条件。

步骤	温度	时间	循环数
预变性	98℃	30s	1
变性	98℃	10s	6～16
退火	65℃	30s
延伸	72℃	30s
终延伸	72℃	5min	1

注意：建议1μg样本起始量时PCR循环数为6个循环，50ng时10个循环，5ng时14～15个循环，PCR循环数也可根据实验需要进行优化。

PCR产物的纯化

• 涡旋振荡MagPure 20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
  
• 将PCR反应液转移至一新的1.5mL离心管中。
  
• 加入1倍样品体积的MagPure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟。
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5分钟）。小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
  注意：不要弃除磁珠。
  
• 继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μL新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
  
• 重复步骤5。
  
• 保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
  
• 将离心管从磁力架上取下，加入30μL EB（自备）或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
  
• 短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将洗脱液转移至一个新的PCR管中约25μL，DNA文库在-20℃保存。

文库质量检测

• 文库浓度
  为了得到高质量的测序结果，需要对DNA文库进行精确定量，首先推荐使用Real-timePCR方法对DNA文库进行绝对定量。此外，还可使用荧光染料法，如Qubit法或荧光染料picogreen法，此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法。最终可使用以下近似公式换算DNA文库的摩尔浓度。
  

  文库平均总长度	近似转换公式	成簇反应DNA文库浓度
  200bp	1ng/μl=7.5 nM	6-12 pM
  300bp	1ng/μl=5.0 nM	6-12 pM
  400bp	1ng/μl=3.8 nM	6-12 pM
  500bp	1ng/μl=3.0 nM	6-12 pM

  
  
• 文库长度分布
  制备好的DNA文库可用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100 Bioanalyzer检测DNA文库中的片段长度分布范围。
  
  图1：Agilent 2100 Bioanalyzer文库分析结果
  L：DNA Ladder；
  S：使用200ng人基因组DNA构建文库，磁珠进行选择回收后结果。
  
• 文库结构
  5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT [Target Sequence] AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
  NNNNNN：index,6bases

附表1：不同片段选择回收时磁珠建议用量

DNA文库大小	插入片段	150bp	200bp	250bp	300～400bp	400～500bp	500～700bp
	（插入片段+adaptor +primer）	270bp	320bp	400bp	400～500bp	500～600bp	600～800bp
磁珠用量	第一次选择	85	70	55	50	45	35
	第二次选择	25	25	20	20	20	15

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