产品货号：
KL230431
中文名称：
人端粒绝对长度检测试剂盒(染料法qPCR)
英文名称：
Human Absolute Telomere Length SYBR qPCR Detection Kit
产品规格：
50T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
背景资料：
产品特点：
产品组成：
保存：-20℃，避光，有效期1年。
注意事项：
使用方法：
一、人端粒DNA/人单基因DNA标曲样本的制备（以101～106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。
二、样本DNA制备
三、染料法qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
四、数据分析
相关搜索：人端粒绝对长度检测试剂盒(染料法qPCR)，人端粒长度检测
本制品是百奥莱博公司基于染料法荧光定量qPCR技术开发的，专门用于测定样本中端粒的总长度的试剂盒。
背景资料：
端粒是指真核细胞染色体末端独特的蛋白质-DNA结构，人端粒由TTAGGG重复串联构成，长度约为30～50 Kb。端粒对于人染色体的稳定非常重要，因此检测人端粒长度具有重要的意义。
产品特点：
- 即开即用，用户只需要提供DNA模板。
- 操作只需要半天，比Southern杂交检测法快3～5天时间。
- 提供端粒阳性对照，可通过标准曲线对待测样本进行绝对定量，能更准确地测定样本中端粒的总长度。
- 提供单拷贝基因阳性对照，可计算待测样本的细胞总数，由于每个细胞端粒数固定，故可计算出每个端粒的长度。
- 精确度好，可以达到几十bp。
- 本制品足够50次20μL体系的绝对端粒长度染料法PCR反应。
产品组成：
| 组分 | 规格 |
| 2×SYBR qPCR MasterMix | 500μL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 超纯水 | 1mL |
| 人端粒染料法qPCR引物干粉 | 50次 |
| 人端粒DNA阳性对照107拷贝/μL | 50μL |
| 人单基因DNA阳性对照107拷贝/μL | 50μL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
注意事项：
- 两个阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。
- 引物干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入110μL的超纯水充分混匀后得到引物混合液再使用，未用完的需要-20℃保存。
使用方法：
一、人端粒DNA/人单基因DNA标曲样本的制备（以101～106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。
- 标记6个离心管，分别为A6、A5、A4、A3、A2、A1。
- 用带芯枪头在第6号管中加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，在其余管中加入45μL荧光PCR专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。
- 在6号管中加入5μL 107拷贝/μL的人端粒DNA阳性对照，充分震荡1分钟，得人端粒DNA浓度均为106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在5号管中加入5μL 106拷贝/μL的人端粒DNA阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得人端粒DNA浓度为105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在4号管中加入5μL 105拷贝/μL的人端粒DNA阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得人端粒DNA浓度为104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 重复上面的操作直到得到6个稀释度的人端粒DNA标准曲线样品。放冰上待用。
- 再标记6个离心管，分别为B6、B5、B4、B3、B2、B1。重复1～6步，将人端粒DNA阳性对照换为人单基因DNA阳性对照，即得6个稀释度的人单基因DNA标准曲线样品。放冰上待用。
二、样本DNA制备
- 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。
三、染料法qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
- 如果有N个样本，每个样本做1次重复，则标记N+13个PCR反应管，N个用于待测样本，1个用于阴性对照，6个用于人端粒DNA标准曲线反应，6个用于人单基因DNA标准曲线反应。如果做三次重复，则反应数需要相应增加。为方便叙述，下面以1次重复为例描述操作流程。按下表在各管中加入下列成分：
成分 样品管 扩增阴性
对照管标曲样本管
(A1～A6号)标曲样本管
(B1～B6号)2×SYBR qPCR MasterMix 各10μL 10μL 各10μL 各10μL 人端粒染料法qPCR引物混合液 4μL 4μL 4μL 4μL 待测DNA样本 各6μL － － － 超纯水 － 6μL － － 人端粒DNA标准曲线样品A1-A6号 － － 各6μL － 人单基因DNA标准曲线样品B1-B6号 － － － 各6μL - 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程 温度 时间 预变性 95℃ 4分钟 PCR反应
（35～40个循环）95℃ 15秒 55℃ 35秒 72℃ 45秒，采集SYBR通道的荧光信号
四、数据分析
- 通过溶解曲线分析排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的结果，归为假阳性，此样本Ct数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
- 如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。如果两种阳性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）无Ct值则无效。
- 如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）是假阳性，有Ct但Tm与阳性样本不同，实验有效可以继续分析其它样品有效数据。
- 确定待测样本端粒浓度(拷贝/μL)：以端粒DNA阳性对照浓度的log值为横轴，以A1～A6管测得有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品有效Ct值为从标准曲线上推算出端粒DNA浓度的log值，再推算出待测样本中端粒的总浓度(总拷贝/μL)。
- 确定待测样本细胞浓度(细胞/μL)：以单基因DNA阳性对照浓度的log值为横轴，以B1～B6管测得有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品有效Ct值从标准曲线上推算出单基因DNA浓度的log值，再推算出其浓度（拷贝/μL）。由于每个细胞有两个单基因，故拷贝/2μL=细胞/μL。
- 由于一个细胞有23对染色体，每条染色体有两个端粒，故一个细胞有92个端粒。如果1μL中有N个细胞，则有92N个端粒。
- 每个端粒的平均长度=端粒总拷贝数(来于第10步)/92N端粒。
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