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端粒是指真核细胞染色体末端独特的蛋白质-DNA结构，人类端粒由TTAGGG重复串联构成，长度为5～15kb。端粒对于染色体的稳定非常重要，其主要通过防止染色体降解及端端融合来维护染色体的稳定和功能。因为线形染色体的末端复制问题，细胞每次分裂，端粒可减少20～200bp，直到达到关键长度，此时细胞步入老化阶段。因此，外周血白细胞的端粒长度与年龄呈负相关，快速检测端粒长度具有重要的意义。

• 即开即用，用户只需要提供外周血DNA模板。
  
• 操作只需要半天，比Southern杂交检测法快3～5天时间。
  
• 端粒和内参的检测在一管内完成，误差小。
  
• 使用PCR扩增，几乎每个分子生物学实验都有相关设备，非常方便。

1. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。用自选方法纯化样品的DNA。用PicoGreen法或NanoDrop仪器对回收的DNA进行纯度测定和定量。纯度必须达到OD260=1.7-1.9。然后统一稀释到50ng/uL，每次PCR用3μL。

2. 如果有N个样品，任选一个样本来稀释，作为标准品。
   
3. 标记5个离心管，分别标注为1～5号，分别对应模板浓度25、12.5、6.3、3.2、1.6、0.8ng/μL。
   
4. 用带芯枪头分别加入50μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头（下同）。
   
5. 在1号管中加入50μL 50ng/uL的阳性对照(第7步制备的N个样本中任选一个)，充分震荡1分钟，得1号标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 换枪头，在2号管中加入1号标准曲线样品(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得2号标准曲线样品。放冰上待用。
   
7. 换枪头，在3号管中加入2号标准曲线样品(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得3号标准曲线样品。放冰上待用。
   
8. 重复上面的操作直到得到5个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

9. 强烈建议每个样本做3次重复，N样本则需要做3N+5+1个PCR反应，多出的5个是用于标准曲线样本，另外一个是无模板阴性对照。按下表加入各成分：
   

   成分	样品管3N个	标准曲线样本5个	阴性对照
   2×SYBR qPCR MasterMix	各10μL	各10μL	10μL
   端粒和内参引物混合液	各3μL	各3μL	3μL
   待测DNA样本	各3μL	不加	不加
   标准曲线稀释液(1～5号)	不加	各3μL	不加
   超纯水	到20μL	到20μL	到20μL

   
   
10. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
    

    过程	温度	时间
    第1步	95℃	15分钟
    第2步 2次循环	94℃	15秒
    	49℃	15秒
    第3步 32次循环	94℃	15秒
    	62℃	10秒
    	74℃	15秒，采集端粒扩增荧光信号
    	80℃	10秒
    	88℃	15秒，采集内参扩增荧光信号
    第4步		熔解曲线分析

11. 熔解曲线分析：熔解曲线分析用于判断扩增是否有效。如果得到Tm分别为78℃（端粒PCR产物）和91℃（内参PCR产物）的两个峰，则表示实验有效，可以进入下一步分析。如果没有同时得到这两个峰，则表示扩增为非特异性扩增，实验无效，不需要分析Ct数据，需要找到原因后再继续实验。
    
12. 制作标准曲线：以标准曲线样本浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制两条标准曲线，一条是用端粒的Ct值绘制，另外一条用内参的Ct值绘制。
    
13. 确定待测样本浓度：通过标准曲线的公式，通过待测样本的端粒Ct和内参Ct，分别计算出样本中端粒的浓度和内参的浓度（ng数），再计算T/S值（即端粒浓度/内参浓度）。由于有三次重复，最后通过三个比值计算出每个样本T/S的平均值。