产品货号：
KL221142
中文名称：
一管式点突变试剂盒
英文名称：
One-Tube Point Mutagenesis Kit
产品规格：
10T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是专门用于从含有野生型DNA插入片段的质粒DNA快速制备突变（包括点突变、插入突变和缺失突变）的试剂盒。
基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。
- 直接使用质粒DNA作为模板，不需要专门制备插入DNA片段。
- 使用超保真酶，PCR过程中不会引入突变。
- 基于PCR扩增，对模板DNA序列没特殊要求，可以用于突变任何DNA位点。
- 模板DNA的需求量很少，只需要1pg～10ng。
- 突变效率高达90%。
- 不但可以制备点突变，还可以制备缺失突变和插入突变。
- 本试剂盒适用于长度为10～15kb的DNA（包括质粒的长度）。
| 组分 | 规格 |
| 10×质粒DNA修复反应液 | 20μL |
| 质粒DNA修复酶 | 20μL |
| 2×超保真PCR MasterMix | 200μL |
| 质粒DNA处理液 | 20μL |
| 超纯水 | 1mL |
保存：-20℃，有效期1年。
质粒DNA、突变引物、细菌转化试剂
一、引物设计及质粒DNA质量
- 共需设计两条完全互补的一对引物，它们要覆盖突变位点，突变位点最好放在引物的中间位置。可以先设计一条，然后通过反向互补原则得到另一条引物。
- 引物的长度通常为25～45个碱基。引物中突变位点左右侧都必需满足Tm大于45℃的条件。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag就达到此标准，突变位点AAG左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45℃。
- 引物的GC含量在40％-60％之间，最3端的1～3个碱基最好是G或C。
- 引物不能产生非常稳定的二级结构，也不能在PCR时形成引物二聚体。
- 引物必须HPLC纯化。
- 本方法是以质粒DNA为模板进行PCR扩增，因此质粒DNA完整性非常重要。如果质粒DNA有大量的nick或gap（限制性内切酶酶切双链DNA不能发现某条单链DNA上是否有nick或gap），则本方法的成功率将会降低。如果质粒宿主菌DNase活性没有去除干净，从中纯化的质粒DNA将会有更多nick。
二、质粒DNA修复（20μL体系，此步不可跳过）
- 质粒预处理可以修复单链上的nick，提高突变效率。
成分 用量 质粒DNA模板 1μg 10×质粒DNA修复反应液 2μL 质粒DNA修复酶 2μL 补超纯水到终体积 20μL 37℃保温2小时，72℃灭活酶
三、质粒DNA修复（20μL体系）
- 按下表设置两个PCR反应：
成分 1号管 2号管 上步所得修复后的质粒DNA 0.1～0.5μg 0.1～0.5μg 2×超保真PCR MasterMix 10μL 10μL 自备引物一(10μM) 1μL 不加 自备引物二(10μM) 不加 1μL 超纯水 至20μL 至20μL - 放入PCR仪器中按下面参数进行PCR：
步骤 温度 时间 循环数 变性 98℃ 3分钟 1 PCR循环 98℃ 40秒 18 60℃ 1分钟 72℃ 30秒/kb（质粒DNA长度） 延伸 72℃ 10分钟 1 保存 4℃ 长时间保持
四、DNA复性
- PCR反应后，将两管DNA反应液汇集在一起，共40μL。
- 加入2μL质粒处理液，混匀后37℃孵育2小时。
- 处理后的反应液可以直接用于细菌转化，或者放-20℃保存备用。
五、转化、挑克隆鉴定
- 用1～5μL上步所得反应液转化100μL感受态细菌（转化效率必须在107/μg以上）。转化流程可以参考分子克隆手册。通常会得到50个以下的克隆，95%是所需要的突变。
- 转化后没有克隆或克隆数极少
- 感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107转化子/μg。
- 把质粒处理液处理后的产物全部用常规的乙醇沉淀法沉淀，再溶解在5μL超纯水中，全部用于转化。
- 质粒DNA放置太久或宿主菌DNase活性高，使得携带的nick比较多，没能彻底修复。
- 感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107转化子/μg。
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