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本试剂盒主要用于酿酒酵母质粒转化实验，该试剂盒遵循广大用户的使用习惯，分别提供PEG、LiAc和Carrier DNA溶液，PEG、LiAc均经过滤除菌，Carrier DNA经特殊优化处理，更有助于提高质粒DNA的转化效率。该试剂盒可根据实际需要灵活配制1×LiAc溶液和转化预混液，既方便使用，又经济实惠。

• 转化全程需无菌操作。
  
• 初次使用Carrier DNA，请把装有Carrier DNA的管子在沸水中煮沸5min，然后立即放在冰上，用后-20℃储存备用。下次使用前在冰上解冻Carrier DNA。反复冻融3～5次后需重新变性Carrier DNA。
  
• PEG溶液在低温环境下会析出，请于常温环境下完全溶解后使用。
  
• 根据质粒浓度增减体积，增加酵母质粒的纯度和浓度可以提高转化效率。

• 感受态细胞制备：
  
  • 活化菌种。-80℃保存的菌种在YPDA培养基平板上划线，30℃培养2～4天。
    
  • 挑取酵母单菌落在YPDA培养基平板上划3～5mm的短线，30℃培养2～4天。
    
  • 待酵母单菌落长至直径2mm时，把酵母细胞接种到3mL YPDA液体培养基中，30℃过夜培养。
    
  • 第二天转接到含有30～50mL YPDA液体培养基的三角瓶中继续培养，待OD600达到0.4-0.5，3000rpm离心5min，弃上清。
    
  • 沉淀用30～50mL的无菌的去离子水悬浮。3000rpm离心5min，弃上清。
    
  • 沉淀用1.5mL 1×LiAc（150μL 10×LiAc Solution加1350μL无菌水）重悬后转移至1.5mL离心管中，3000rpm离心5min，弃上清。
    注意：10×LiAc Solution经过pH缓冲，无需添加TE作为缓冲剂。
    
  • 加入1mL 1×LiAc重悬，小体积转化按照每管100μL分装，用于文库转化不分装。
    
  • 3000rpm离心5min，弃上清，感受态细胞即制备完毕。
    注意：制备好的感受态最好立即使用，在第8步离心前，室温放置不应超过5小时。
• 转化预混液配制：
  

  成分	质粒转化预混液	文库转化预混液
  PEG Solution	240μL	1680μL
  10×LiAc Solution	36μL	252μL
  Carrier DNA	10μL	40μL
  质粒	5μL（≈200ng/μL）	5～15μg（文库质粒）
  总体积	360μL（ddH2O补足体积）	2520μL（ddH2O补足体积）

  
  
• 酵母质粒转化：
  
  • 将360μL预混液加入1支感受态细胞中，反复吹吸沉淀，使酵母细胞彻底悬浮于预混液中。
    
  • 30℃的水浴锅中孵育30min，每10min混匀一次。
    
  • （加入20μL DMSO，可选）42℃的水浴锅中热击30min，每10min混匀一次。
    
  • 12000rpm离心15 s，弃上清液。
    
  • （可选步骤）用1mL YPD Plus Liquid Medium重新悬浮，30℃摇床震荡培养30～60min。12000rpm离心15 s，弃上清液。
    
  • 加入0.1～1mL无菌去离子水或0.9%氯化钠溶液重悬沉淀，涂筛选培养基平板，30℃培养2～4天。
• 酵母文库转化：
  需用15～50mL离心管
  
  • 将2520μL预混液加入到感受态细胞（未分装）沉淀中，震荡使感受态细胞充分重悬。
    
  • 放置在30℃的水浴锅中孵育50min，每10min混匀一次。
    
  • （加入160μL DMSO，可选）放置在42℃的水浴锅中热击30min，每10min混匀一次。
    
  • 3000rpm离心5min，弃上清液。
    
  • （可选步骤）用3mL YPD Plus Liquid Medium重悬沉淀，30℃摇床震荡培养90min，3000rpm离心5min，弃上清液。
    
  • 加入15mL无菌去离子水或0.9%氯化钠溶液重悬菌体，涂筛选培养基平板（50个平板左右），30℃培养2～4天。