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本试剂盒经过系列转录反应体系的优化，通过T7 RNA Polymerase从模板DNA T7启动子下游开始合成与DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

本试剂盒一个反应可以转录产生150～200μg的RNA，转录合成的RNA可用于诸如RNA结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。

• 合成单链RNA；
  
• 合成高特异性RNA探针；
  
• 合成siRNA前体；
  
• 制作RNA剪接反应(RNA splicing)的前体。

• 模板效率和孵化时间：
  本试剂盒以1μg的模板投入量可以产生150～200μg的RNA，然而，不同模板的产量会因模板的序列、结构、长度、纯度以及特定RNA聚合酶启动子的序列和长度而有所不同。影响转录产量的污染物包括核糖核酸酶或污染物，如苯酚、微量金属和SDS。
  
• 优化的反应：
  推荐的反应条件可适用于大多数模板的体外转录，但是，对于某些模板，可以通过延长反应时间(4小时-过夜反应)，增加模板的用量来提高产率。
  
• 模板含量：
  下表总结了我们在调控模板数量方面的经验。结果可能因使用的模板而异，将反应时间延长至4～6小时可增加RNA的产量。
  

  模板量	RNA产量
  1000ng(1μg)	130～160μg
  500ng (0.5μg)	110～130μg
  100ng (0.1μg)	30～50μg
  50ng(0.05μg)	15～25μg
  10ng(0.01μg)	10～20μg
  1ng(0.001μg)	3～8μg

  
  
• 保持RNase-free环境：
  使用无RNase管和移液枪；处理含有RNA的试剂盒组件或样品时应戴手套，并经常更换手套，特别是接触到RNase的潜在污染源，如门把手、钢笔、铅笔和人体皮肤后。不使用时，应将所有试剂密封好。在孵育过程中，将所有含有RNA的试管密封。
  
• 由于10×Transcription Buffer浓度偏高，高盐环境会导致聚合酶失活，同时buffer中含有亚精氨成分，会与模板DNA形成沉淀，配制反应液时需调整组分加样顺序，计算好体系，先加水，然后加buffer，NTP，最后加模板和酶，以防止10×的高浓度盐离子对酶造成影响。
  
• 模板制备：
  带有双链T7启动子的线性化质粒、PCR产物或者合成的DNA片段都可以作为本试剂盒体外转录模板，模板可用TE缓冲液或RNase-free Water溶解。
  
  • 质粒模板（建议每个反应加1μg线性化质粒作为模板）
    带T7启动子的质粒可以作为转录模板，质粒的线性化和纯度会影响转录的产量及RNA的完整性。环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化，线性化的质粒请确保双链为平末端或编码链5’端为突出结构。
    
  • PCR产物模板（建议每个反应加0.1μg～1μg作为模板）
    带T7启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。PCR扩增模板时将T7启动子加在有义链的上游引物的5’端。PCR产物经纯化后作为模板。
    
  • 合成的DNA模板（建议每个反应加0.1μg～0.5μg作为模板）
    合成的带有T7启动子的DNA片段也可以作为体外转录的模板。

• 体外转录
  
  • 将除T7 RNA Polymerase Mix外的组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用。
    
  • 加入以下各组分：
    

    成分	用量
    10×Transcription Buffer	2μL
    ATP/GTP/CTP/UTP Mix	各1.5μL
    Template DNA	X μl
    Enzyme Mix	1μL
    RNase-Free Water	至20μL

  • 用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育3h。
    注：为避免蒸发对反应体系的影响，建议在PCR仪中进行反应。可根据产物片段大小适当的调整反应时间，如合成小于0.3kb的RNA，可将反应延长至4h或更长时间，16h过夜反应不会影响产物的质量。
    
  • 在反应体系中加入1μL的DNase I，37℃孵育15min，消化转录的DNA模板。(可选)
    注：相对于产物RNA，模板DNA的含量非常低，一般不用去除，也可以用DNaseI消化。
    
  • 合成的RNA经电泳分析、纯化后，可用于下游实验。
    注：产物浓度极高，需用RNase-free Water稀释后再检测。
  
  
• 产物纯化
  
  • 酚/氯仿纯化法
    酚/氯仿抽提可去除蛋白和大部分游离核苷酸。
    
    • 加入160μL RNase-free Water将产物稀释至180μL。
      
    • 加入20μL 3M的醋酸钠(pH5.2)到稀释后的产物中，用移液器充分混匀。
      
    • 加入200μL的酚/氯仿混合液(1：1)进行抽提，室温10000rpm离心5min，将上层溶液（水相）转移至新的RNase-free EP管中。
      
    • 加入与水相等体积的氯仿抽提2次，收集上层水相。
      
    • 加入2倍体积的无水乙醇并混匀，-20℃孵育至少30min，4℃ 15000rpm离心15min。
      
    • 弃上清并加入500μL预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃ 15000rpm离心，弃上清。
      
    • 开盖干燥2min，加入20～50μL RNase-free Water或其他缓冲液溶解RNA沉淀。
      
    • -80℃保存。
  • 柱纯化
    柱纯化可以去除蛋白和游离核苷酸。
    纯化前加入80μL RNase-free Water将产物稀释至100μL，再按柱纯化说明书进行纯化。
    注：由于RNA产量较高，为避免超出结合柱的承载能力，请对所需柱子数量进行预估。
    
  • 磁珠纯化
    磁珠纯化可以去除蛋白和游离核苷酸。
    按磁珠纯化说明书进行纯化。
    
  • 氯化锂纯化
    
    • 20μL体积分别加入30μL的氯化锂沉淀溶液（7.5M氯化锂，50mM EDTA）和30μL RNase-Free Water（氯化锂的终浓度需保持在2.5-2.8M）；
      
    • 混匀后放入-20℃放置至少30min。
      
    • 12000rpm离心15min，去上清，收集沉淀。
      
    • 用预冷的70%的乙醇洗三次。
      
    • RNase Free Water复溶后检测。
• RNA定量
  
  • 紫外吸收法：
    游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。
    
  • 染料法：
    用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或者未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。

• 质粒模板线性化时，如何选择限制性内切酶？
  带有启动子的质粒可以作为转录模板，质粒的线性化和纯度会影响转录的产量及RNA的完整性。环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化，线性化的质粒需确保双链为平末端或编码链5’端为突出结构。因此需要选择可以产生平末端或编码链5’端为突出结构的II类限制性内切酶，并且酶的识别位点为稀有位点。
  
• 转录模板的纯度有要求吗？
  模板DNA应为RNaseA-Free、高纯度，建议OD260/280为1.8~2.0。
  
• 转录模板必须要去除吗？
  最好在转录结束后添加DNase I去除模板。
  
• 转录产物产量低或转录失败：
  建议做一个对照组和一个实验组。若对照组产量低，请联系百奥莱博技术支持。若对照组实验产量正常但实验组产量低，可能存在模板本身的质量问题导致产量低，请尝试以下方案解决：
  
  • 实验模板中有抑制反应的成分，建议重新纯化模板，确定模板定量及其完整性；
    
  • 实验模板序列问题，建议延长37℃反应时间，加大模板投入量或尝试其他启动子和RNA聚合酶。
    
  • 由于10×Transcription Buffer浓度偏高，高盐环境会导致聚合酶失活，同时buffer中含有亚精氨成分，会与模板DNA形成沉淀，配制反应液时需调整组分加样顺序，计算好体系，先加水，然后加buffer，NTP，最后加模板和酶，以防止10×的高浓度盐离子对酶造成影响。
• 短片段转录产物产量低：
  转录产物小于0.3kb时，延长反应时间或增加模板量可以提高RNA产量。
  
• 产物电泳拖尾现象：
  
  • 实验操作过程被RNase污染；
    
  • DNA模板被RNase污染；
    建议重新纯化模板DNA，所有实验过程注意RNase污染控制。
• RNA产物片段大于预期：
  质粒模板没有完全线性化或有义链3’端为突出结构，建议重新线性化质粒模板，确保线性化完全及线性化的质粒请确保双链为平末端或编码链5’端为突出结构；
  RNA存在未完全变性的二级结构，更换变性胶检测RNA产物。
  
• RNA产物片段小于预期：
  
  • 模板序列中包括类似于T7 RNA聚合酶的终止序列导致转录提前中止，建议更换RNA聚合酶尝试；
    
  • 模板中形成高级结构，建议加入SSB蛋白尝试；
    
  • RNase污染。