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本制品是一种使用新型核酸纯化介质包被的磁珠，用于稳定、高效、便捷地从各种生物制品的中间品、半成品和成品中提取并纯化残留的大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物等宿主细胞微量DNA的试剂盒。本试剂盒制备的DNA样品可以用于相关DNA残留qPCR检测试剂盒。

本试剂盒的原理和操作流程如图1所示。样品中蛋白首先被蛋白酶K消化，释放出来的基因组DNA在特定条件下与磁珠特异性结合。在外界磁场(如磁分离架)的作用下，磁珠与相应溶液可以快速高效地分离。随后通过两次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液将DNA从磁珠上洗脱下来。整个过程无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，全程仅需约20分钟即可完成。

• 本试剂盒可搭配大肠杆菌DNA残留检测试剂盒等残留DNA检测试剂盒用于残留检测，使用E.coli DNA Control模拟样品的回收率测试结果见下表。
  

  回收前残留DNA浓度	回收前体积	回收后残留DNA浓度	回收后体积	回收率
  30fg/μL	100μL	32.6fg/μL	100μL	109%
  3fg/μL	100μL	3.08fg/μL	100μL	103%

  • 回收率和样品浓度、体积、样品种类及实验操作等的不同而存在差异，表中数据仅供参考。
    
  • 根据中华人民共和国药典(2020年版·三部)“外源性DNA残留测定法”中“第三法定量PCR”对于结果计算的要求，加标样品的回收率应在50%～150%之间。
• 本试剂盒在提取低至飞克水平的残留DNA时仍具有较高的回收率，通常无需添加糖原、酵母RNA或Poly A等Carrier RNA或Oligo dT等Carrier DNA。使用本试剂盒对100μL模拟待测样品(含BSA)以及对应的加标样品(即在待测样品基础上再添加一定量的标准品)进行样品制备操作，并使用大肠杆菌DNA残留检测试剂盒检测样品浓度。回收率计算结果见下表。
  

  重复	待测样品CT值	待测样品lgCT	待测样品浓度	加标样品CT值	加标样品lgCT	加标样品浓度	回收率
  1	33.53	0.97	9.36fg/μL	31.6	1.54	35.0fg/μL	85.4%
  2	34.30	0.74	5.53fg/μL	31.84	1.47	29.7fg/μL	80.5%
  3	33.82	0.89	7.68fg/μL	31.73	1.51	32.0fg/μL	81.1%

  • 上表中用于计算样品浓度的E.coli DNA标准曲线公式为：Y = -3.371X + 36.80，其中Y为CT值，X为该待测样品浓度的对数，斜率和Y轴截距是由荧光定量PCR仪自动生成。上表中用于计算加样回收率的公式为：(加标样品的浓度-待测样品的浓度)×洗脱体积/加标量。洗脱体积为100μL，加标量为3000fg E.coli DNA。

• BalbMag磁珠长期不使用时，可以4℃保存，4℃可以保存更长时间。蛋白酶K和Glycogen室温(15～25℃)存放，至少一周有效。
  
• 首次使用前，洗涤液Ⅰ按3∶1的比例加入无水乙醇(如21mL的洗涤液Ⅰ加入7mL无水乙醇)；洗涤液Ⅱ按2∶3的比例加入无水乙醇(如16mL的洗涤液Ⅱ加入24mL无水乙醇)。
  
• 首次使用前洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ需按照说明书和标签上的指示添加无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
  
• 磁珠在静置后会发生沉降，使用前一定要适当涡旋震荡或颠倒数次至充分混匀。
  
• 磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。
  
• 请使用推荐的样品量。如果样品量过大，可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响抽提获得的DNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善抽提效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少样品用量。
  
• 本试剂盒的某些步骤需使用55℃水浴，请提前作好准备。
  
• 除特别说明外，每次Vortex应控制在5～10秒左右。
  
• 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。
  
• 建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系，这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。

• 需要用户自备的耗材、仪器和试剂：
  
  • 磁分离装置、水浴锅、涡旋振荡器。
    
  • 无核酸酶的吸头、无核酸酶离心管(1.5mL)，无水乙醇、PBS。
• 样品准备：
  
  • 如果样品为中间品或半成品，宿主细胞DNA残留较多，为了保证检测的准确性，使检测值在标准曲线线性范围之内，需要用PBS进行适当比例稀释后再纯化提取。
    
  • 如果样品为干粉形式，可用超纯水将样本稀释成1～100mg/mL后使用。
• 样品DNA提取：
  
  • 收集100μL样品于1.5mL离心管中，加入100μL PBS并混匀。
    
    • 如果预计残留量非常少并且没有低吸附的吸头、离心管，建议在每个样品中添加1μL Glycogen (20mg/mL)以提高提取效率、减少核酸吸附损耗；也可进一步添加酵母RNA或Carrier RNA，具体用量参见相关产品说明书。
    • 建议每个样品进行平行的三次DNA提取处理。
  • 加入20μL蛋白酶K，混匀。55℃孵育30分钟。
    
    • 若样品中蛋白浓度＞50mg/mL，建议增加蛋白酶K的用量至40μL，或者延长孵育时间至60分钟。
  • 加入200μL无水乙醇，Vortex混匀。
    加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部用于和磁珠的结合，沉淀不会影响抽提效果。
    
  • 向步骤c中的混合物加入20μL BalbMag磁珠悬液(使用前务必混匀)，轻柔混匀后，室温放置5～10分钟(每隔3分钟涡旋混匀10秒)。将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸除残液。
    磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要，可适当增加磁珠用量，延长结合时间以提高得率。
    
  • 加入500μL洗涤液Ⅰ，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
    
  • 加入600μL洗涤液Ⅱ，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
    
  • 将离心管室温放置5～10分钟，或置于37℃鼓风烘箱5分钟，确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。
    
  • 加入50～100μL洗脱液，轻柔震荡使磁珠悬于溶液中，室温孵育3～5分钟，其间甩动离心管1～2次。将离心管置于磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸取溶液至新离心管中，置于-20℃保存。所得溶液即为纯化的总DNA。