石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒

产品货号：

YTB5664

中文名称：

石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒

英文名称：

Paraffin-embedded Tissue Genomic DNA Purification Spin Kit

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本制品是一种采用环保脱蜡方式去除石蜡后DNA柱式提取的试剂盒，获得的DNA可以应用于PCR、qPCR或基因组学研究等下游实验。

福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)常应用于癌症等疾病研究中保存离体组织的形态学和组织学结构，以便于运输和储存，是病理样品长期保存的主要方法之一。组织样品经福尔马林固定时，组织内细胞中的核酸和蛋白质等分子间随机交联，核酸出现片段化，因此难以获得高质量核酸。本试剂盒采用环保脱蜡法去除石蜡，以特殊的裂解条件释放FFPE组织样本中的DNA分子，最大程度地降低了福尔马林固定时组织内细胞中DNA与其它分子交联的不利影响，经本试剂盒抽提获得的DNA纯度高、完整性好、质量稳定。

本试剂盒抽提获得的石蜡包埋组织样品基因组DNA纯度高。本试剂盒提供的纯化柱对于DNA的最大容量约为30μg，抽提获得的DNA A260/A280的范围通常在1.6～1.9之间。
本试剂盒使用安全、高效。本试剂盒通过特殊的柱纯化介质进行DNA分离纯化，能有效避免常规方法抽提DNA时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂。
本试剂盒操作快速、便捷。本试剂盒采用柱纯化，无需繁琐的DNA沉淀步骤，纯化DNA操作过程仅需约15分钟即可完成。和国外同类柱纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。百奥莱博同时提供更加便捷的磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒。

组分	规格
脱蜡剂	50mL
样品裂解液A	10mL
样品裂解液B	11mL
洗涤液I	13mL
洗涤液II	26mL
洗脱液	11mL
蛋白酶K	1.1mL
DNA纯化柱及废液收集管	50套

保存：室温，其中蛋白酶K需置于-20℃，有效期1年。

注意事项

蛋白酶K室温(15～25℃)存放一周，活力无明显下降。
本试剂盒的标准操作步骤抽提得到的总DNA含有少量RNA，但如果按照可选步骤加入RNase A，就可以获得不含RNA的高纯度总DNA。
如果希望获得更高质量的DNA，宜尽量使用新鲜固定和包埋的组织样品。拿到组织样品后尽快在4～10%福尔马林中固定，固定时间最好在8～24小时之间或更短时间，长时间固定会使DNA断裂更为严重。
样品包埋前应确保彻底脱水，残留的甲醛可能抑制蛋白酶K的消化等相关实验步骤。
本试剂盒提取DNA依赖于样品类型、储存时间以及固定条件。样品固定时间和保存时间过长(＞1年)易破坏DNA完整性，无法抽提出长片段。
如需制备不含RNA的高纯度总DNA，需自备RNase A，推荐使用RNase A(100mg/mL，不含DNase)。
温度较低时样品裂解液A或样品裂解液B中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍，如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。
第一次使用前小包装洗涤液I需添加17mL无水乙醇，洗涤液II需添加39mL无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
本试剂盒须将FFPE样品56℃和90℃孵育。
使用本试剂盒须提前备好无水乙醇。
除特别说明外，每次Vortex应控制在5～10秒左右。
本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。

本试剂盒提取DNA的实验流程如图1所示。首先使用环保的脱蜡剂和蛋白酶K将FFPE样品脱蜡、消化，随后加入适合DNA结合到纯化柱上的缓冲液，然后加入到纯化柱内。通过高速离心，使DNA在穿过纯化柱的瞬间，结合到纯化柱上，随后通过三次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液把DNA洗脱下来。

图1．石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒的实验流程图。

使用效果

图2．石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒与T品牌同类竞品的DNA抽提效果对比图。样品为小鼠肾脏和肝脏组织石蜡切片，样品用量为5片10μm厚切片。抽提后洗脱体积均为50μL，取10μL的洗脱样品与2μL 6×DNA上样缓冲液混合均匀后，在1%琼脂糖凝胶中电泳30分钟后拍照。如图所示，本试剂盒用于抽提小鼠肾脏、肝脏FFPE样品的DNA时，抽提得到的DNA的量与T品牌的同款试剂盒基本一致或略好。

提取得到的gDNA经RNase A处理。实际结果会因样品、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

样品处理：
- 石蜡包埋组织蜡块：手术刀切或刮取约10～25mg的组织样品(尽量去除组织周围的石蜡块)。
  - 较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效率提高。
- 石蜡包埋组织切片：取5～8张的石蜡切片(5～10μm厚，表面积小于1×1cm2)。
  - 如果样品表面暴露于空气中，尽量避免使用。
- 福尔马林固定组织：取10～25mg福尔马林固定液中的组织，用手术刀充分切碎后，置于1.5mL离心管中，加入500μL的PBS(pH7.4，无酶无菌)，Vortex震荡混匀，12000×g离心1分钟后充分去除上清，再重复清洗2次，然后从步骤2b开始操作。
脱蜡和裂解：
- 将石蜡块样品或者石蜡切片置于1.5mL离心管中，加入600μL的脱蜡剂，剧烈Vortex 30秒，以充分脱蜡。
  - 福尔马林固定液中的组织样品无需加脱蜡剂，直接转入步骤2b开始操作；如果石蜡样品过多，可以将脱蜡剂用量增加至1mL。
- 加入180μL样品裂解液A和20μL蛋白酶K，Vortex混匀，56℃金属浴或水浴孵育1小时或直至样品完全裂解。
  - 裂解过程中可多次从金属浴中取出离心管颠倒混匀以促进裂解。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1～3小时内完成。为方便起见，可以直接过夜裂解，过夜裂解对DNA抽提效果通常无负面影响。
- 将完全裂解的组织样品置于90℃孵育1小时，之后短暂离心使盖子上的蒸发液体回到管中。
  - 90℃孵育对解开DNA与其它分子的交联至关重要，但是必须严格控制孵育的温度和时间，否则可能产生更多的DNA碎片，因此应先将金属浴或水浴加温至90℃再放入样品进行孵育。
- 将离心后的离心管室温静止5分钟，用吸头缓慢穿过上层脱蜡剂，吸取下层的澄清液体(约180μL)至新的离心管中。
- 清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度DNA，加入2μL的RNase A(100mg/mL，不含DNase)，Vortex混匀。室温放置2分钟后，进行下一步操作。
  - 如果残余的少量RNA对后续下游实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤2f。
- 向上述新的离心管中加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀；再加入200μL无水乙醇，Vortex混匀。
  - 加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，需立即Vortex混匀，但不会干扰后续实验；加入无水乙醇后也可能产生白色沉淀，必须Vortex充分混匀，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。
纯化DNA：
- 将步骤2f中的混合溶液加入到DNA纯化柱内。≥6000×g (约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
  - 进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
  - 必须将步骤2f中的溶液和白色沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
- 向纯化柱中加入500μL洗涤液I，≥6000×g (约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
  - 进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
- 向纯化柱中加入600μL洗涤液II，≥18000×g (约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
  - 进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
- 重复步骤3c一次。
- 再≥18000×g (约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
  - 不可把步骤3d的离心时间延长而省略本步骤，倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
- 将DNA纯化柱置于一洁净的1.5mL离心管上，加入30～100μL洗脱液。室温放置1～3分钟。≥18000×g (约≥12000rpm)离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
  - 洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。洗脱液的pH对洗脱效率有很大影响，使用去离子水洗脱时应保证其pH值在7.0～8.5之间。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在第一次洗脱后，再用同体积洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可增加DNA洗脱量，但会降低洗脱DNA的浓度。经65℃预热过的洗脱液可增加DNA的洗脱量。

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