DNA/RNA/蛋白共提试剂盒

产品货号：

WH0056

中文名称：

DNA/RNA/蛋白共提试剂盒

英文名称：

DNA/RNA/Protein Isolation Kit

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

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本试剂盒可从培养的动物细胞或者组织中快速同步提取DNA、总RNA和总蛋白，可同时处理大量不同样品。1小时左右可完成反应。可用于PCR、RT-PCR和蛋白检测等多种分子生物学下游实验。

试剂盒特点：

方便：从同一样本中同时得到DNA、RNA和总蛋白。
快速：1h左右可完成一次抽提。
安全：提取过程无需酚氯仿有机物。
可靠：可用于下游实验。

试剂盒组成：

组分	规格
裂解液RL	30mL
去蛋白液RW1	40mL
漂洗液RW	12mL
RNase-Free ddH2O	15mL
RNase-Free吸附柱CR3（含2mL收集管)	50套
吸附柱CB3	50个
缓冲液GD	13mL
漂洗液PW	15mL
洗脱缓冲液TB	15mL
RNase-Free离心管（1.5mL)	100个
RNase-Free离心管（2mL)	50个
RNase-Free收集管（2mL)	50个
蛋白沉淀剂PR	220mL
蛋白溶解缓冲液SP	15mL

储存条件：室温保存一年，加入β-巯基乙醇的裂解液RL 4℃可放置一个月。

选配试剂：DNaseI （目录号：WH0051)

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇

预防RNase污染，应注意以下几方面：

经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（V/V)，放置过夜，高压灭菌。）

使用前注意事项：

操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度为1%，如1mL RL中加入10μL β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RL 4℃可放置一个月，裂解液RL在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热至56℃溶解并平衡至室温后使用。
第一次使用前应在漂洗液RW、PW和缓冲液GD中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
以下操作如非指明，均在室温下进行。
对于某些敏感的RNA应用实验可能需要完全去除DNA，可以参照DNase I消化流程在柱上进行。

操作步骤：

一、从培养细胞中同时提取DNA和总RNA

收集细胞：
悬浮细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：估计细胞数量，300g离心5min，将细胞收集到离心管中，仔细吸除所有培养基上清。
单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）：可直接在培养容器中裂解（容器直径不超过10cm），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法。）
- 直接裂解法：确定细胞数量，彻底吸除细胞培养基上清，立即进行第2步裂解步骤。
- 胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.10～0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至1.5mL RNase-Free的离心管中，300g离心5min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。
注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，影响RNA与吸附柱的结合，造成RNA的产量降低。
裂解处理：
对于离心得到的细胞沉淀：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液RL（见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），旋涡震荡30sec。
沉淀细胞数量裂解液RL
＜5×10⁶ 350μL
5×10⁶～1×10⁷ 600μL

对于直接裂解的细胞：RL（见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），将细胞裂解液转移至离心管中，涡旋震荡30sec。
容器直径裂解液RL
＜6cm 350μL
6～10cm 600μL
将所有溶液转移至DNA吸附柱CB3 （吸附柱CB3放在2mL RNase-Free离心管中)，12000rpm （~13400×g)离心30～60sec，收集滤液。将吸附柱CB3放在收集管中室温或4℃放置至后续提取DNA。

A．总RNA提取：

向滤液中加入1倍体积70%乙醇（通常为350μL或600μL），混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR3中（RNase-Free吸附柱CR3放入离心管（此管自备)中），12000rpm(~13400g)离心30～60sec，保留离心管中的液体（用于沉淀蛋白），将RNase-Free吸附柱CR3放入收集管中。
注意：配制70%乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70%乙醇用量。将溶液和沉淀转移至RNase-Free吸附柱CR3时，如果体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。
向RNase-Free吸附柱CR3中加入700μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
向RNase-Free吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12000rpm(~13400g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
重复步骤6。
12000rpm(~13400g)离心2min，倒掉废液。将RNase-Free吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将RNase-Free吸附柱CR3在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中，加入100μL RNase-Free ddH2O室温放置2min，12000rpm(~13400g)离心2min，得到RNA溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

B．基因组DNA提取：

向DNA吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD （使用前请先检查是否已加入乙醇），12000rpm(~13400g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12000rpm(~13400g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
重复步骤11。
12000rpm(~13400g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CB3在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
将吸附柱CB3转入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中，加入100μL洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm(~13400g)离心2min，得到DNA溶液。

C．蛋白质提取流程见说明最下方。

二、从动物组织中同步提取DNA和总RNA

匀浆处理：
切割小块组织加入适量裂解液RL（见下表，使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），用电动或玻璃匀浆器将组织彻底研磨。旋涡震荡30sec。
起始组织量裂解液RL
10～20mg 350μL
≥ 20mg 600μL
12000rpm(~13400g)离心3～5min，小心吸取上清至DNA吸附柱CB3 （吸附柱CB3放在2mL RNase-Free离心管中)，12000rpm(~13400g)离心30～60sec，收集滤液。将吸附柱CB3放在收集管中室温或4℃放置至后续提取DNA。

A．总RNA提取：

向滤液中加入1倍体积70%乙醇（通常为350μL或600μL），混匀（此时可能会出现沉淀）。
注意：配制70%乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70%乙醇用量。
得到的溶液和沉淀一起转入RNase-Free吸附柱CR3中（RNase-Free吸附柱CR3放入2mL RNase-Free离心管中），12000rpm(~13400g)离心30～60sec，保留离心管中的液体（用于沉淀蛋白），将RNase-Free吸附柱CR3放入收集管中。
注意：将溶液和沉淀转移至RNase-Free吸附柱CR3时，如果体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。
向RNase-Free吸附柱CR3中加入700μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
向RNase-Free吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12000rpm(~13400g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将RNase-Free吸附柱CR3放回收集管中。
重复步骤6。
12000rpm(~13400g)离心2min，倒掉废液。将RNase-Free吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将RNase-Free吸附柱CR3在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
将RNase-Free吸附柱CR3转入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中，加入100μL RNase-Free ddH2O室温放置2min，12000rpm(~13400g)离心2min，得到RNA溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

B．基因组DNA提取：

向DNA吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD （使用前请先检查是否已加入乙醇），12000rpm(~13400g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12000rpm(~13400g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
重复步骤11。
12000rpm(~13400g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CB3在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
将吸附柱CB3转入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中，加入100μL洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm(~13400g)离心2min，得到DNA溶液。

DNase I消化流程（可选）：
DNase I储存液的配制：将DNase I干粉（1500U）溶解在550μL RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月）。
注意：从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃（可保存6周），不要再次冻存。

按照总RNA提取流程1－4步进行提取。
向RNase-Free吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400g)离心30～60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的1.5mL RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。
向RNase-Free吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。
向RNase-Free吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(~13400g)离心30～60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
按照RNA提取流程6～9步进行提取。

蛋白质提取：

将提取完RNA的流出液中加入四倍体积的冷丙酮（客户自备）或蛋白沉淀剂PR，充分混匀，冰上或-20℃放置10～30min。（请根据体积选择相应的离心管，离心管客户自备）。
注意：丙酮沉淀后的蛋白比PR沉淀的蛋白难溶解，但是沉淀的蛋白量较多，可根据试验的需要来选择。
12000rpm，4℃，离心10min，弃上清。
加入100μL冰冷的95%乙醇于沉淀中，4℃，最大转速离心1min，用移液器吸出上清，尽可能去除上清。
室温干燥沉淀。
注意：干燥不彻底也许会由于乙醇的残留导致蛋白上样出现问题，过分干燥会使蛋白沉淀比较难溶。
加入100μL或适量的蛋白溶解缓冲液SP（采用缓冲液SP溶解之后的蛋白样品适用于SDSPAGE及Westernblot试验，但不适合采用Bradford方法进行蛋白定量，如需采用Bradford方法进行蛋白定量可采用5%SDS溶解蛋白，亦可根据下游的试验选择适合的蛋白溶解缓冲液），加入的蛋白缓冲液的体积根据初始样本量及下游试验要求来确定。

蛋白样品如需进行SDS-PAGE电泳可进行如下操作：
样品中加入蛋白loading buffer，95℃变性5～10min，然后冷却样品至室温。
最大转速离心1min，沉淀残余的未溶解物质，吸取上清进行下游的试验如SDS-PAGE和Western Blot等。溶解的蛋白可以-20℃保存数月或者4℃数天。

沉淀细胞数量	裂解液RL
＜5×10⁶	350μL
5×10⁶～1×10⁷	600μL

容器直径	裂解液RL
＜6cm	350μL
6～10cm	600μL

起始组织量	裂解液RL
10～20mg	350μL
≥ 20mg	600μL

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