酵母质粒小提试剂盒(1～5mL)

产品货号：

WH0039

中文名称：

酵母质粒小提试剂盒(1～5mL)

英文名称：

Yeast Plasmid DNA Mini Kit (1-5mL)

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本试剂盒对普通的碱裂解法进行了改进，可快速得到高纯质粒DNA，并祛除基因组DNA。通过离心吸附柱吸附、洗涤DNA，方便快速，不需使用有毒有害试剂，可同时处理多个样品。除适用于酵母细胞外，也可用于大肠杆菌。质粒得率与酵母菌株、质粒拷贝数、培养条件等因素有关。

试剂盒组成：

组分	50T
平衡液BL	30mL
溶液YP1	15mL
溶液YP2	15mL
溶液YP3	20mL
去蛋白液PD	30mL
漂洗液PW	15mL
洗脱缓冲液EB	15mL
RNaseA（10mg/ml)	150μL
吸附柱CP2	50个
收集管（2mL)	50个

保存条件：
室温（15～25℃)干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2～8℃。2～8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。溶液YP1加入RNase A后，应置于2～8℃，可稳定保存6个月。单独包装的RNase A可在室温保存12个月。

需要自备的试剂：

Lyticase（货号：WH0216)
山梨醇buffer：用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)配制1.2M山梨醇
0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)的配制：
77.4mL 0.1mol/L Na2HPO4+22.6mL 0.1mol/L NaH2PO4

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)

溶液YP1使用前先加入RNaseA （将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2～8℃保存。
使用前先检查平衡液BL、溶液YP2和YP3是否出现浑浊，如有混浊现象，可置于37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
溶液YP2和YP3使用后应立即盖紧盖子。
所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为12000rpm （~13400×g)。
提取的质粒量与酵母菌的培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。
实验前使用平衡液处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。
用平衡液处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。

使用方法：
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

柱平衡步骤：向吸附柱CP2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
取1～5mL酵母培养物（不超过5×10⁷酵母细胞），12000rpm （~13400×g)离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
酵母细胞壁的破除：
- 酶法：向菌体中加入300μL山梨醇buffer，加入大约50U Lyticase，充分混匀，并在摇床上220rpm，30℃处理1h。4000rpm（~1500×g)离心10min，弃上清，收集沉淀。加入250μL溶液YP1（请先检查是否已加入RNase A）重悬沉淀。
  注意：以上Lyticase的用量和处理时间为经验值，根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同，所用Lyticase的浓度和孵育时间应该进行适当调整。
- 玻璃珠法：向菌体中加入250μL溶液YP1（请先检查是否已加入RNase A）重悬沉淀，彻底悬浮菌体。加入0.1g直径为0.45～0.55mm的酸洗玻璃珠，涡旋振荡10min。
向管中加入250μL溶液YP2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分混匀，室温放置5～10min。
注意：温柔混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠。
向管中加入350μL溶液YP3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm （~13400×g)离心20min。
注意：YP3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
小心地将上清液加入吸附柱CP2中（吸附柱放入收集管中），12000rpm （~13400×g)离心1min，倒掉废液，将吸附柱CP2放入收集管中。
向吸附柱CP2中加入500μL缓冲液PD，12000rpm （~13400×g)离心1min，倒掉废液。
向吸附柱CP2中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g)离心1min，倒掉废液，将吸附柱CP2放入收集管中。
重复操作步骤8。
将吸附柱CP2放入收集管中置于12000rpm （~13400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP2开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm （~13400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，再次离心。

补充说明：

通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或者分光光度计法都很难检测到。提取的质粒如果用于下一步实验，通常建议使用量为：
可使用1～5μL用作PCR模板。
可使用5～10μL用于转化大肠杆菌。
转化大肠杆菌时应使用商业化高转化效率的感受态细胞，如我公司公司的货号为WH0190和WH0189等产品。

产品目录