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本试剂盒适用于从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中有效纯化总DNA，包括基因组DNA和线粒体DNA。本制品使用专门优化的裂解液和蛋白酶K，释放福尔马林固定或组织切片样本中的DNA，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除由福尔马林交联造成的抑制作用，有效提高DNA的产量和纯度；优化的缓冲系统使裂解液中的DNA可特异结合到硅胶吸附膜上，而其他污染物可流过膜；PCR和酶反应的抑制剂以及残留的杂质可通过两步漂洗步骤有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。经过纯化的DNA可以直接用于PCR、Real-time PCR、SNP基因分型、STR基因分型和药物基因组学研究等。

• 向蛋白酶K中加入1.25mL蛋白酶K储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
  
• 获得样品后，要尽快将样品在4%～10%的福尔马林中固定，固定时间以14～24小时为宜，时间过长易导致基因组断裂，影响下游实验。
  
• 确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制蛋白酶K的作用。
  
• 第一次使用前应按试剂瓶标签说明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
  
• 使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GL和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解。
  
• 如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μL DNase-Free的RNase A(100mg/mL)，RNase A本试剂盒并未提供，如果需要可单独向本公司订购，货号：WE0225。

• 样本处理：
  
  • 石蜡包埋样本：用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织。
    
  • 福尔马林等固定液中的样本：取约20mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500μL 10mM PBS(PH7.4)，涡旋振荡，12000rpm(～～13400×g)离心1分钟，重复3次，可直接进行第7步操作。
• 将组织块切成5～10μM的薄片。
  
  • 如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2～3片弃掉不用。
• 取约1×1cm2的切片(共约4～5片切片)置于离心管(自备)中，加入1mL二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
  
• 12000rpm离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
  
• 加入1mL无水乙醇，涡旋震荡混匀。12000rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
  
  • 乙醇可以除去样品中残余的二甲苯。
• 打开管盖，室温或最高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留。
  
• 加入180μL Buffer GTL，重悬沉淀；加入20μL蛋白酶K，涡旋震荡混匀。
  
• 56℃孵育1小时，直至样品完全溶解。90℃孵育1小时。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
  
  • 此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成DNA断裂，产生DNA碎片。
    
  • 56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃孵育。
    
  • 如需除去RNA，可将样品温度降到室温后，加入4μL浓度为100mg/mL的RNase A溶液(货号：WE0225)，震荡混匀，室温放置5～10分钟。
• 加入200μL Buffer GL，涡旋震荡彻底混匀。加入200μL无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
  
  • 加入Buffer GL和无水乙醇后要立即充分混匀。
    
  • 如果需要对多个样品进行操作，可以将Buffer GL和无水乙醇事先混匀后加样。
• 将步骤9所得溶液全部加入已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
  
  • 这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。
• 将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入20～100μL Buffer GE或灭菌水，室温放置2～5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
  
  • 如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
    
  • 离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
    
  • 用另外的20～100μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
    
  • 如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤14所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤14；若洗脱体积小于100μL，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用20μL Buffer GE或灭菌水洗脱。
    
  • 因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。