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本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法及硅胶膜吸附技术，可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒DNA；独特的内毒素沉淀技术，无需过滤，操作简便。本试剂盒适用于从5～15mL过夜培养的细菌培养物中提取质粒，所得质粒可直接用于细胞转染、酶切、连接、转化、PCR、测序等分子生物学实验。

• 高纯度：采用独特的内毒素沉淀技术，特异的去除内毒素。
  
• 高效转染：适合包括内毒素敏感细胞在内的绝大多数细胞的转染。
  
• 操作简便：采用吸附柱技术特异吸附质粒，无需过滤，操作更为简便。
  
• 应用广泛：动植物细胞转染、分子生物学实验均可应用。

• RNase A溶液可常温运输，收到后将其置于-20℃可保存2年。
  
• 加入RNase A后的Buffer P1置于2～8℃可保存6个月。

• 细菌培养时间一般为12～16h，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒质量甚至导致突变。
  
• 每次使用时需观察Buffer P2和Buffer P4是否形成沉淀，如有沉淀于37℃溶解后使用。
  
• 用平衡液处理过的柱子建议立即使用，放置时间过长影响使用效果。
  
• 第一次使用前，按照瓶上标签向Buffer W1中加入56mL无水乙醇。
  
• Buffer P1加入RNase A后置于2～8℃保存。
  
• 各溶液使用后请立即盖紧盖子。
  
• 所有操作均在室温下进行。
  
• 质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数、质粒的稳定性等因素有关。

• 柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液Buffer BL（当天处理），12000rpm（~13400×g)离心1min，弃去收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 取5～15mL过夜培养的菌液，12000rpm离心1min，弃上清。
  
• 加入500μL Buffer P1（使用前将试剂盒提供的RNase A全部加入），旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。
  
  确保菌体沉淀悬浮均匀，含未悬浮菌块会影响裂解，导致提取质粒的浓度及纯度降低。
• 加入500μL Buffer P2，温和颠倒混匀使菌体完全裂解。
  
  不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA的污染；所用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，请减少菌体使用量。
• 加入500μL Buffer P4，立即温和颠倒混匀，至溶液出现白色絮状物。12000rpm离心10min，使白色沉淀离至管底（可适当增加离心时间），小心将上清液转移至干净离心管（自备）中（不要带入沉淀）。
  
  • Buffer P4加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
    
  • 离心后在最上层可能会形成一层致密的漂浮膜，注意不要倒入吸附柱。
• 加入150μL内毒素清除液ERB，颠倒混匀。
  
  内毒素清除液ERB可能会出现分层，不影响使用，使用前摇匀即可。
• 加入0.3倍上述上清液体积的异丙醇，颠倒混匀（加入异丙醇过多容易导致RNA污染）。
  
• 将步骤7所得混合溶液转移到平衡好的吸附柱EC (吸附柱最大容积为700μL，所得溶液需分次过柱)中，12000rpm离心1min，弃收集管中的滤液。
  
• 向吸附柱中加入600μL Buffer W1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，弃滤液。
  
• 重复步骤9。
  
• 将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2min。
  
• 将吸附柱EC置于新的2mL离心管中，开盖放置5min，彻底挥发乙醇。
  
• 在吸附膜的中间部位加入100～300μL洗脱缓冲液EB（60～65℃预热效果更好），常温放置2min，12000rpm离心1min，即得质粒DNA（如需较多量DNA，可将得到的溶液重新转入吸附柱，重复此步骤）。

• 质粒DNA产量低？
  
  • 质粒拷贝数低、质粒>10kb或革兰氏阳性菌质粒。应加大菌体使用量，洗脱缓冲液EB 60℃水浴预热，吸附和洗脱时间可以适当延长，以增加提取效率。
    
  • 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前建议先划线活化，以稳定产量。
    
  • 细菌未充分裂解。细菌须在Buffer P1/RNase A中充分重悬或菌体不宜过多，避免成团或过量的细菌无法裂解降低产量。
• 质粒DNA中有基因组DNA污染？
  
  • 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在12～16h。
    
  • 裂解问题。加入Buffer P2时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，从加入Buffer P2时算起，总时间不要超过5min。