无内毒素质粒大量提取试剂盒(100～200mL菌液)

产品货号：

SN0017

中文名称：

无内毒素质粒大量提取试剂盒(100～200mL菌液)

英文名称：

ColPure Endotoxin-Free Maxi Plasmid Kit

产品规格：

10T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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简要说明：

本试剂盒采用改良的碱裂解处理方法及硅胶膜吸附技术，可特异、高效地获得无内毒素高纯度质粒DNA；柱上直接去除内毒素，操作简便。所得质粒可直接用于细胞转染、酶切、连接、转化、PCR、测序等分子生物学实验。高拷贝质粒，100mL菌液通常可获得500～1500μg质粒，低拷贝质粒，200mL菌液通常可获得200～600μg质粒。

产品特点：

操作简便：柱上快速去除内毒素，其他步骤亦简便高效。
纯度高：沉淀致密，去杂干净。
颜色指示：关键步骤颜色变化指示判断。

适用范围：

本试剂盒适用于从100mL～200mL细菌培养物中提取多至1500μg的高纯度无内毒素的质粒DNA。

产品组成：

组分	规格
RNase A (10mg/mL)	1.0mL
Buffer BL	25mL
Buffer I	100mL
Buffer II	100mL
Buffer III	100mL
Endotoxin Removal Buffer	60mL
Buffer W1	60mL
Buffer EB	30mL
吸附柱EC及收集管	10个
收集管	10个

保存：室温，有效期1年。

用户自备：
无水乙醇、异丙醇、50mL离心管。

注意事项：

细菌培养时间一般为12～16h，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒质量甚至导致突变。
每次使用时需观察Buffer II和Buffer III是否形成沉淀，如有沉淀于37℃溶解后使用。
用平衡液处理过的柱子建议立即使用，放置时间过长影响使用效果。
第一次使用前，按照瓶上标签向Buffer W1中加入180mL无水乙醇。
Buffer I加入RNase A后置于2～8℃保存。
各溶液使用后请立即盖紧盖子。
所有操作均在室温下进行。
质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数、质粒的稳定性等因素有关。

使用方法：

柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入2.5mL的平衡液Buffer BL（当天处理），10000rpm离心2min，弃去收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中。
取100～200mL（对于高拷贝质粒，建议100mL菌液；对于低拷贝质粒，建议200mL菌液，最高不超过300mL菌液）过夜培养的菌液，10000rpm离心2min，弃上清。
加入10mL Buffer I（使用前将试剂盒提供的RNase A全部加入），旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀，呈现出均匀混浊的棕红色。
确保菌体沉淀悬浮均匀，含未悬浮菌块会影响裂解，导致提取质粒的浓度及纯度降低。
加入10mL Buffer II，温和颠倒混匀使菌体完全裂解，直至溶液变成清亮、粘稠的紫红色。
不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA的污染；所用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Buffer II的用量，在后续的操作中按倍数增加Buffer III的用量。
加入10mL Buffer III，立即温和颠倒混匀，可见红黄相间的絮状物产生，继续混匀直至完全变为黄色。10000rpm离心10min，小心将上清转移至干净离心管（自备）中（不要带入沉淀）。
- Buffer III加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有紫色漂浮物，说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。
- 离心后在最上层可能会形成一层致密的漂浮膜，注意不要倒入吸附柱。
- 如果实验室采用吊篮式离心机，不是固定转子，转速达不到10000rpm，可以采用吊篮离心的最大转速4250g，离心10min。
加入0.3倍滤液体积的异丙醇，颠倒混匀（加入异丙醇过多容易导致RNA污染）。
将步骤6所得混合溶液转移到平衡好的吸附柱EC (已放入收集管)中，10000rpm离心1min，弃收集管中的滤液（吸附柱最大容积为15mL，即上步中所得溶液需分2～3次过柱）。
如果离心机转子倾角较大时，建议加入吸附柱的溶液体积不超10mL，以防漏液。
向吸附柱EC中加入5mL Endotoxin Removal Buffer，静置5min，10000rpm离心1min，弃滤液。
加入10mL Buffer W1（使用前检查是否已加入无水乙醇），10000rpm离心1min，弃滤液。
加入5mL Buffer W1，10000rpm离心1min，弃滤液。
将吸附柱EC放回空收集管中，10000rpm离心5min。
将吸附柱EC置于新的50mL离心管中，开盖放置5min，彻底挥发乙醇。
在吸附膜的中间部位加入1～2mL洗脱液Buffer EB（60～65℃预热效果更好），常温放置2min，10000rpm离心2min，即得质粒DNA（如需较多量DNA，可将得到的溶液重新转入吸附柱，重复此步骤）。

常见问题：

质粒DNA产量低？
- 质粒拷贝数低、质粒>10kb或革兰氏阳性菌质粒。应加大菌体使用量，可使用300～500mL过夜培养物，洗脱液Buffer EB 60℃水浴预热，吸附和洗脱时间可以适当延长，以增加提取效率。
- 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前建议先划线活化，以稳定产量。
- 细菌未充分裂解。细菌须在Buffer I/RNase A中充分重悬或菌体不宜过多，避免成团或过量的细菌无法裂解降低产量。
质粒DNA中有基因组DNA污染？
- 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在12～16h。
- 裂解问题。加入Buffer II时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，从加入Buffer II时算起，总时间不要超过5min。

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