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储存条件：常温保存，保质期1年，RNase A溶液和内毒素清除剂2～8℃保存，保质期1年。
产品简介：
本试剂盒采用独特的缓冲系统，结合传统的异丙醇沉淀方法，可快速地获得大量高纯度的质粒DNA。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和转染多种细胞等实验。
产品内容：
注：实验前请仔细阅读说明书。
注意事项：
a.裂解液II如有沉淀，37℃水浴溶解后使用。
b.裂解液II含NaOH，使用后请及时拧紧瓶盖，防止变质。
c.需自备异丙醇、70%乙醇和50mL离心管。
d.RNase A和内毒素清除剂，4℃保存12个月有效，-20℃可长期保存。
e.第一次使用时，将试剂盒所带的RNase A加入悬浮液I中，之后置于4℃保存。
f.纯化液III请置于4℃冰箱预冷。
g.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加I、II、III的用量；TE推荐在65～70℃水浴中预热。可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
操作步骤：
细胞裂解
1.离心收集50～200mL过夜培养的细菌(高拷贝质粒建议50～100mL，低拷贝质粒建议100～200mL)，室温10,000rmp离心5min(或5,000rmp离心10min)。
2.向菌体沉淀中加入10mL悬浮液I(已加入RNase A)，使用移液器吹打沉淀彻底混匀，静置3～5min。
3.向上述混合液中加入10mL裂解液II，立即温和上下颠倒离心管6～8次，室温静置5～10min左右至混合液变清亮，请勿静置过长时间。
注意：为避免基因组DNA污染和质粒断裂，切勿剧烈震荡离心管，请勿静置超过10min。加入裂解液II后会变半透明粘稠状。
4.加入10mL预冷的纯化液III，立即温和上下颠倒离心管6～8次，冰上静置10min。4℃ 10000rpm离心15min(或5,000rmp离心30min)。
质粒DNA纯化
1.将上述离心后的上清液用针头过滤器过滤到新的50mL离心管中。
2.在过滤后的上清中加入18mL异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置10min。
3.4℃ 10000rpm离心15min(或5,000rmp离心30min)。小心倒掉上清液(请勿触及离心管壁白色沉淀)并倒置在吸水纸上。
4.在室温下用5mL 70%乙醇涮洗管壁，10000rpm离心5min，小心倒掉上清液(请勿触及离心管壁白色沉淀，如果白色沉淀脱落，可以再次离心)，倒置于吸水纸上轻轻沥干残余液体。
质粒DNA内毒素去除(此步骤可以重复1～2次)
1.在上述沉淀中加入1.5mL(体积可适当减少，后续内毒素清除剂的量按比例减少)的TE完全溶解沉淀，转移到两个1.5mL离心管中，每管750μL。
2.每管加入75μL内毒素清除剂A(1/10体积)，充分混匀，冰浴5min。
3.每管再加入75μL内毒素清除剂B(1/10体积)，充分混匀，冰浴10min(此时溶液为透明红色)。
4.将离心管颠倒混匀后置于60℃水浴5min(此时溶液变浑浊)。
5.室温12000rpm离心5min分相(室温需高于20℃，否则内毒素清除剂无法分相)，小心吸取上清(下层为红色，上清为无色)于新的离心管中(如未分相，请重复60℃水浴后再离心)。
质粒DNA回收
1.在上步所得上清中加入等体积的异丙醇(约750μL)，颠倒混匀，4℃ 12000rpm离心5min。轻轻倒掉上清液(请勿触及离心管壁白色沉淀)。
2.加入1mL 70%乙醇涮洗管壁，12000rpm离心5min，小心吸弃上清，室温晾干。
3.加入适量的水或者TE溶解沉淀。
质粒DNA浓度及纯度检测
1.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为多条带，这些条带是质粒的多聚体造成的，不影响后续的酶切、转染等实验。OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA。
2.纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.8～2.0左右，可直接应用于分子生物学等常规操作。如果溶解时不使用缓冲液，而使用ddH2O，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。
相关搜索：去内毒素质粒大提试剂盒(沉淀法)，Plasmid MaxiPrep Kit(Endotoxin free)