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本制品是我司最新研制成功的一种动物基因组DNA提取试剂盒。本制品对经典的SDS裂解液进行了改良，并使用高浓度的蛋白变性剂，大大提高了裂解的效率，缩短了裂解的时间。无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂。从25mg动物组织可以获得8～15μg DNA，OD260/OD280比值一般为1.7~1.9。

本试剂盒适用广泛，亦可用于动物组织、细胞、福尔马林固定组织等样品的基因组DNA提取。提取出的DNA可用于酶切、PCR、Southern blot等相关实验。

• 该试剂盒中提供的Proteinase K溶液为特别优化的配方，方便使用，而且非常稳定，可以在室温保存半年以上而活性不受明显影响，如需进一步延长保存期限，请置4℃保存。
  
• Buffer ACL和Buffer CL中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

• 准备工作：
  
  • 自备材料：水浴锅、小型高速离心机（最大离心力≥ 12000×g）、1.5mL离心管、无水乙醇、RNase A (10mg/mL)等。
    
  • 试剂盒初次开启，按瓶身标签说明在CW1 Solution、CW2 Solution中加入相应量的无水乙醇混匀后在瓶身做好标记。于室温密封保存。（13mL CW1 Solution加17mL无水乙醇，9mL CW2 Solution加21mL无水乙醇；26mL CW1 Solution应加入34mL无水乙醇，18mL CW2 Solution应加入42mL无水乙醇。）
    
  • 每次使用前请检查Buffer ACL和Buffer CL是否出现沉淀，如有沉淀，请于56℃溶解后使用。
• 操作步骤
  
  • 样品处理
    
    • 动物组织：取约25mg动物组织用液氮研磨成粉末加到1.5mL离心管中，加入180μL Buffer ACL，再加入20μL
      Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。
      
      • 通常动物组织完全裂解需要1~3h，取样过多会影响提取DNA的质量（动物组织取样量应≤ 25mg，动物脾脏取样量应≤ 10mg，小鼠尾巴最大用量为1.2cm长片段，大鼠鼠尾巴最大用量为0.6cm长片段，并将裂解时间延长至6~8h）。
        
      • 水浴过程中，每10min颠倒混匀一次，可促进细胞裂解。
        
      • 如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20μL RNase A（10mg/mL），室温放置2～5min。
    • 贴壁培养细胞：弃尽培养液，每10cm2细胞加入200μL Buffer PBS和20μL Proteinase K，轻轻晃动培养瓶，收集细胞转移至新的离心管中，再加入200μL Buffer CL，震荡混匀，56℃水浴10min，继续进行抽提步骤中3～8步骤。
      
      • Buffer PBS需自备（150mM Sodium Chloride,50mM Potassium Phosphate,pH=7.2）
        
      • 水浴过程中，每3min颠倒混匀一次，可促进细胞裂解。
        
      • 如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20μL RNase A（10mg/mL），室温放置2～5min。
    • 悬浮培养细胞：收集5×10⁶细胞，离心去除培养液，加入200μL Buffer PBS和20μL Proteinase K，混匀。再加入200μL Buffer CL，震荡混匀，56℃水浴10min，继续进行抽提步骤中3～8步骤。
      • Buffer PBS需自备（150mM Sodium Chloride,50mM Potassium Phosphate,pH=7.2）
        
      • 水浴过程中，每3min颠倒混匀一次，可促进细胞裂解。
        
      • 如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20μL RNase A（10mg/mL），室温放置2～5min。
  • 加入200μL Buffer CL，充分颠倒混匀。
    
    • 加入Buffer CL后，如有沉淀产生，可70℃水浴10min。
  • 加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。
    
    • 加入无水乙醇后可能会产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。
  • 将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液。
    
  • 将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL CW1 Solution，10000rpm离心30 s，倒掉收集管废液。
    
    • 使用前注意溶液中是否按比例加入无水乙醇。
  • 将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μL CW2 Solution，10000rpm离心30 s，倒掉收集管废液。
    
    • 使用前注意溶液中是否按比例加入无水乙醇。
  • 将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的CW2 Solution。
    
    • 将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的CW2 Solution，CW2 Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。
  • 取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50～200μL CE Buffer静置3min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
    
    • 如果想提高DNA的得率，可重复步骤8。

• 准备工作：
  
  • 自备试剂：PBS Solution（150mM Sodium Chloride,50mM Potassium Phosphate,pH=7.2）、无水乙醇、RNase A（20mg/mL）等。
    
  • 从福尔马林固定组织中获得的基因DNA完整性与样品保存时间相关，样品保存时间越长，获得的基因DNA就越不完整。此类样品保存时间一般都比较长，获得的DNA通常小于650bp。
    
  • 加入Buffer ACL后，56℃水浴至细胞完全裂解，通常动物组织完全裂解需要1～3小时。可根据样品的差别适当延长56℃水浴水浴时间，至细胞完全裂解。
    
  • 样品固定剂建议选用乙醇或福尔马林，有交联作用的固定剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于基因组DNA提取。
• 标准抽提步骤
  
  • 取10～25mg福尔马林固定组织，放入1.5mL离心管中。
    
    • 取样时尽量取中间部分，因为福尔马林对DNA有一定的破坏作用。
  • 用PBS溶液漂洗两次，去除组织表面残留的福尔马林溶液
    
  • 加入180μL Buffer ACL，再加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。
    
    • 通常动物组织完全裂解需要1～3小时，如果裂解不完全可适当延长水浴时间。
      
    • 如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20μL的RNase A（20mg/mL），室温放置2～5分钟。
  • 继续进行标准抽提步骤中2～8步骤。
    
    • 福尔马林会使固定的样品基因组DNA发生断裂，获得的DNA通常小于650bp。

• 未获得DNA
  
  • 使用的样品量过少，以至于凝胶电泳或吸光度测定无法检测，可适当增加样品用量。
    
  • 对于快速抽提方法而言，用75%乙醇漂洗，倒掉残夜时需要防止沉淀随之丢失。沉淀量较少时，用75%乙醇漂洗后应12000rpm离心2min，小心吸去上清，避免沉淀丢失。
    
  • 对于柱式抽提方法而言，漂洗液CW1 Solution、CW2 Solution初次使用请按瓶身标签说明加入相应量的无水乙醇。否则，DNA将在漂洗过程中流失。
• 获得的沉淀无法全部溶解
  
  • 使用的样品量过多，可适当减少样品用量。
    
  • 动物组织等材料富含糖原，加入8mM NaOH充分溶解后有不溶物是正常现象，应12000rpm离心2min，取上清。一般不影响后续实验。
• 获得的DNA浓度很低
  
  • 使用的样品量过少，可适当增加样品用量。
    
  • 样品研磨不充分，取样后应将样品充分研磨，使样品和裂解液充分接触，确保样品完全裂解。
    
  • 没有选择合适的洗脱液或没有按照洗脱说明操作，需按严格按说明书洗脱DNA。
• 获得DNA断裂、降解
  
  • 样品没有按要求冷冻保存，建议使用新鲜样品用液氮进行研磨，样品如果因为某些原因必须先行保存，可以将样品保存于-70℃冰箱。
    
  • 样品反复冻融，需要保存的样品应分割后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融，以确保样品的DNA未降解。
    
  • 样品研磨不充分，用液氮研磨样品时，应注意研磨充分，加入裂解液后充分混匀。
    
  • 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，应严格按说明书操作。
• 过柱离心吸附柱有时会堵塞
  
  • 样品裂解时间过短，样品裂解不完全导致，应适当延长裂解时间至裂解液澄清。
    
  • 加入Buffer CL后，如有沉淀产生，应70℃水浴10分钟至澄清。
    
  • 样品使用量过大，应减少样品用量，取样不要超过说明书上的最大样品用量。
• DNA样品不纯，抑制或干扰后续实验反应
  
  • 漂洗液75%乙醇有残留，由于用户使用的离心管质量不同，残液会有不同程度的挂壁现象，所以可以倒掉液体后短暂高速离心，用移液器吸去残液。
    
  • 75%乙醇漂洗不充分，漂洗时应将沉淀悬浮起来，尤其是当核酸沉淀较大时，以确保去除盐等小分子杂质。
    
  • DNA在洗脱前，有漂洗液残留，抑制后续酶解和PCR反应。加入洗脱液前，吸附柱应打开盖子于室温放置5～10分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的CW2 Solution。
• 利用琼脂糖凝胶电泳检验DNA时，加样孔非常亮
  
  • 大片段的基因组DNA由于难以电泳出加样孔，会使加样孔非常的亮。
    
  • 使用的琼脂糖凝胶浓度过高，建议使用0.7﹪的琼脂糖凝胶进行电泳。
    
  • 获得的DNA中含有蛋白等杂质，建议适当减少样品用量。