产品货号：
GS0037
中文名称：
柱式酵母质粒DNA抽提试剂盒(1mL)
英文名称：
SPIN-10 Column Yeast Plasmid Preps Kit(1mL)
产品规格：
50次|100次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒抽提酵母质粒时，利用Snailase酶去除酵母的细胞壁，再采用常规的碱裂解法裂解细胞，经过沉淀、离心除去基因组DNA、蛋白质和RNA，经吸附柱选择性地吸附DNA，再通过简单的洗涤步骤除去非特异性结合的杂质，洗脱得到纯度较高的质粒，可直接用于转化、DNA测序、PCR、基于PCR的突变、体外转录、酶切等后续实验。
- 采用传统的碱裂解方法和酶法相结合，操作过程快速、方便。
- 无需使用酚/氯仿抽提，无需乙醇沉淀。
- 抽提得到的质粒纯度高。
| 组分 | 50次 | 100次 |
| Solution I | 15mL | 30mL |
| Solution II | 15mL | 30mL |
| Solution III | 20mL | 40mL |
| Wash Solution | 12mL | 24mL |
| Elution Buffer | 5mL | 10mL |
| RNase A | 210μL | 420μL |
| Snailase | 300mg | 600mg |
| Buffer DW1 | 25mL | 50mL |
| Visualysis | 60μL | 120μL |
| Snailase Storage Buffer | 2.5mL | 5mL |
| Snailase Reaction Buffer | 35mL | 70mL |
| 吸附柱及收集管 | 50套 | 100套 |
保存：室温，其中RNase A收到后，请及时存放于2～8℃，长期贮存请于-20℃放置。加入RNase A后，Solution I请存放于2～8℃，有效期为半年。
- 自备试剂：无水乙醇等。
- 试剂盒初次开启，将RNase A溶液全部加入Solution I中，混匀后在瓶身做好标记。储存于2～8℃，有效期为6个月。。
- Solution II、Solution III在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于37℃溶解沉淀，待冷却至室温后使用。
- 按瓶身标签说明在Wash Solution中加入4倍体积的无水乙醇，混匀后在瓶身做好标记。于室温密封保存。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。若Wash Solution由于运输或保管不当造成容量不准，请用量筒定容后再加入相应体积的无水乙醇。
- Snailase比较难溶解，请提前将Snailase加入Snailase Storage Buffer，涡旋混匀使酶溶解，如溶解不完全，可以将Snailase置于冰箱4℃过夜溶解。待完全溶解后分装，-20℃冰箱保存备用。
- 提前将水浴锅调至37℃备用。
- 对于高拷贝质粒，取1mL酵母培养物（不超过1×107酵母细胞），室温8000rpm离心2min收集菌体，倒尽或吸干培养基。
- 大部分质粒在酵母中的拷贝数较低，如需增加得率，请用2～5mL菌体，同时按比例相应增加Solution I、II和III的用量，或同一个样品分多管收集，每管不超过5mL，分别裂解，合并同一个样品的各管裂解液通过同一个吸附柱来获得更高的得率。
- 酵母细胞壁的去除：菌体沉淀中每20mg湿重加入600μL酶解缓冲液，加1.2μL的β-巯基乙醇和50μL实验前准备好的Snailase，37℃温浴3h。5000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。在菌体沉淀中加入250μL Solution I，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。
- 如果使用lyticase，则取600μL酶解缓冲液加入菌体沉淀中，加1.2μL的β-巯基乙醇，再加入大约含有300U的Lyticase储存液。充分混匀，37℃，温浴2小时。
- Solution I首次使用时请检查是否已加入RNase A。
- 一定要彻底悬浮菌体，否则影响得率和质量。
- 如果使用Visualysis，则在加入250μL P1后再加入1μL Visualysis，振荡混匀。
- Visualysis需在临用前加入，直接加入到Buffer P1中出现浑浊为正常现象。
- 如果使用lyticase，则取600μL酶解缓冲液加入菌体沉淀中，加1.2μL的β-巯基乙醇，再加入大约含有300U的Lyticase储存液。充分混匀，37℃，温浴2小时。
- 加入250μL Solution II，立即温和颠倒离心管5～10次混匀，室温静置2～4min。
- 裂解时间与菌量相关，菌量多则适当延长时间，最长不能超过5分钟。
- 如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法，计时从第一管样品加入开始。
- 以溶液由浑浊变澄清且粘稠，为裂解完全的标志。
- 裂解时间与菌量相关，菌量多则适当延长时间，最长不能超过5分钟。
- 加入350μL Solution III，立即温和颠倒离心管5～10次充分混匀。
- 如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法。
- 加入Solution III后，离心管中会立即出现大量白色絮状沉淀。
- 如果起始菌液较多，混匀后室温静置2分钟以彻底去除RNA。
- 如果同时操作多个样品，每加入一管混匀一管，不要采用全部加入一起混匀的方法。
- 12000rpm离心10min。
- 离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小悬浮物可再次离心，或延长离心时间，待完全沉淀后再取上清。
- 将上清全部小心移入吸附柱，室温放置2min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
- 吸附柱的最大有效容积为750μL，如果裂解液较多，可以重复该步骤直至所有裂解液流过吸附柱。
- 向吸附柱中加入500μL Buffer DW1，10000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
- 向吸附柱中加入500μL Wash Solution，10000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
- Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。
- 重复步骤8一次。
- 将空吸附柱和收集管放入离心机，12000rpm离心2min。
- 此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
- 将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室温静置2min，10000rpm离心1min。
将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。- Elution Buffer为2.5mM Tris-HCl，pH8.5，可以用TE或水（pH＞7.0）代替。
- 将Elution Buffer预热至60℃可以进一步提高得率。
- 如果质粒> 8kb，加入Elution Buffer后，在37～60℃温浴2分钟可以显著提高得率。
- 使用小于40μL的洗脱液可以得到更高的质粒浓度，但得率会降低。
- 洗脱体积不能低于30μL。
- Elution Buffer为2.5mM Tris-HCl，pH8.5，可以用TE或水（pH＞7.0）代替。
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