产品目录

M13和其它的丝状噬菌体载体，在文库构建和为序列测序提供单链DNA和引人突变方面十分有用。将适量M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物离心，上清中的单链噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，将盐、细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净噬菌体单链DNA从硅基质膜上洗脱。

• 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 节省时间，简捷，单个样品操作一般可在10分钟内完成。
  
• 产量高，典型的产量800μL M13丝状噬菌体上清可以提取3μg噬菌体单链DNA。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9。可以直接用来测序，一般典型可辨认读长达850bp。

• 结合液MB低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 漂洗液WB第一次使用前按瓶子标签指示加入无水乙醇。
  
• 所有的离心均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的台式离心机。
  
• 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
  
• 结合液MB含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

• 第一次使用前请按照漂洗液WB瓶标签指示中加入无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 以800μL噬菌体感染细菌培养上清提取举例。

• 柱平衡：向吸附柱EC中加入100μL平衡液，13000rpm离心1min，弃滤液，备用。
  
  • 平衡液可以增强硅胶膜的吸附核酸能力，请使用当天处理的吸附柱。
• 将M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物分装在1.5mL离心管，13000rpm离心5min沉淀菌体。
  
• 小心取800μL上清转入新的1.5mL离心管，加入400μL结合液MB，充分混匀。
  
  • 如果使用的上清大于或者小于800μL，则结合液MB的用量需要按照比例增加或者减少。
• 将上述混合物加入一个吸附柱EC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液。
  
  • 吸附柱一次最多只可以容纳大约700μL混合物，因此需要分次把混合物加到吸附柱内，重复步骤4。
• 加入600μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），13000rpm离心15sec，弃废液。
  
• 将吸附柱EC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在70℃水浴中预热），室温放置2min，13000rpm离心1min。
  
  • 可将第一次洗脱所得溶液重新加入离心柱中，室温放置2min，13000rpm离心1min。可以提高浓度10%左右。
    
  • 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于30μL，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
• DNA可以存放在-20℃，如果要长时间存放，可以放置在-70℃。

• 低核酸产量或者纯度不高
  
  • 试剂盒储存在非最佳条件。
    建议：收到试剂盒后总是存放在室温（15～20℃）
    
  • 缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下-建议：储存在室温（15～20℃），每次用完后立刻盖紧盖子，以免溶液蒸发，pH改变和污染。
    
  • 漂洗液WB中忘记加无水乙醇。
    建议：第一次实验时，在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。
    
  • 试剂和样品没有充分混匀。
    建议：加入每个试剂后都要充分混匀
    
  • 噬菌体上清滴度太低。
    建议：离心取噬菌体感染细菌培养物上清时离心最好不要超过5min，转速不要超过12000rpm，否则噬菌体上清也可能离心下来。重新培养一次噬菌体感染细菌
    
  • 洗脱效率不高。
    建议：确保做了步骤6，否则残留乙醇会影响洗脱效率，仔细阅读步骤7和只使用洗脱缓冲液EB洗脱
• DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
  
  • 忘记做步骤6，乙醇抑制了酶切反应。
    建议：做步骤6，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。
    
  • 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应。
    建议：将洗脱的基因组DNA溶液13000rpm再离心1min，小心取上清使用。
• 纯化的DNA产物D260数值异常偏高
  
  • 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了分光光度计读数。
    建议：将洗脱的回收DNA溶液13000rpm再离心1min，小心取上清使用。
  
  
  
  M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程：
  下面举例说明M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程，详细的M13噬菌体（或M13来源噬粒）培养和上清准备过程请参见『分子克隆』第二版。
  
  • 37℃振摇过夜培养合适的噬菌体宿主菌（如JM109）。
    
  • 使用6％的过夜培养菌接种新鲜的LB培养液，37℃振摇培养1小时。
    
  • 根据M13噬菌体的储存液的浓度（滴度）按照0.5～1.5%(V/V)的比例加入噬菌体来感染宿主菌。37℃振摇培养5～6个小时。
    
  • 将上面M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物分装在1.5mL离心管，12000rpm离心5min沉淀菌体。
    
  • 可选步骤:小心取1mL上清转入新的1.5mL离心管，重复步骤4离心5min。
    
    • 这步有助于去除上清中残留的微量宿主菌RNA或者DNA。
  • 小心取800μL上清转入新的1.5mL离心管。
    
  • 现在可以按照操作步骤提取噬菌体单链DNA了。
  
  相关搜索：M13噬菌体单链DNA提取试剂盒，M13噬菌体DNA提取，M13基因组DNA提取，M13单链DNA提取，M13 ssDNA rapid extraction kit