产品货号:
ALH099
中文名称:
PCR产物DNA纯化回收试剂盒
英文名称:
PCR product purification recovery Kit
产品规格:
50次|100次|200次
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒适用于PCR反应产物、酶切产物DNA片段、探针标记纯化回收,DNA样品浓缩等。在高离序盐存在的情况下,DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将引物、核苷酸、蛋白、酶等杂质去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。
- 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
- 使用了优质结合液,不含传统结合液的碘化钠和高氯酸盐,不抑制回收后酶切、连接克隆等下游反应。
- 结合液调制成为了黄颜色,便于监测pH值变化从而达到最佳结合效果,大大提高回收效率。
- 快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。
组分 | 50次 | 100次 | 200次 |
平衡液 | 5mL | 10mL | 20mL |
结合液BB | 30mL | 60mL | 100mL |
漂洗液WB | 13mL | 25mL | 50mL |
洗脱缓冲液EB | 10mL | 15mL | 20mL |
吸附柱EC | 50个 | 100个 | 200个 |
收集管(2mL) | 50个 | 100个 | 200个 |
保存:室温,有效期1年。
- 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。使用前应该恢复到室温
- 储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃~25℃)进行。
- 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
- 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
- 硅胶膜吸附柱使用前先用平衡液预处理,具体方法参见附录参考“关于平衡液的使用”。
- 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
- 结合液中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水或者生理盐水冲洗。
- 回收纯化的DNA片段一般在100bp到40kb之间,过长、过短片段的回收效率迅速降低。
- 回收DNA的量和起始DNA的量,洗脱体积,DNA片断大小有关。一般1~15μg,100bp~5kb的DNA片段,回收率可高达95%。
- 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱,DNA片段应该保存在-20℃。DNA片段如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
- 每100μL PCR扩增后体系或者酶切后体系加入500μL结合液BB,充分混匀。(如果初始体系小于100μL,请事先用双蒸水调整至100μL)。
- 将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中),室温放置1分钟,12000rpm离心30~60秒,倒掉收集管中的废液。
使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见附录参考“关于平衡液的使用”。
过滤下的结合液和收集管内残存的强碱性平衡液混合后,可能会从黄色变成橘红甚至紫色,此为酚红pH指示剂碱性条件下的正常颜色变化。 - 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12000rpm离心30秒,弃掉废液。
- 加入600μL漂洗液WB,12000rpm离心30秒,弃掉废液。
- 将吸附柱EC放回空收集管中,12000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 取出吸附柱EC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴中加热效果更好),室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟。如果需要较多量DNA,可将得到的溶液重新加入吸附柱中,离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于25μL,体积过小降DNA洗脱效率,减少产量。
- 核酸产量低或者纯度不高
- 试剂盒储存在非最佳条件
建议:收到试剂盒后总是存放在室温(15℃~20℃)。 - 缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下
建议:储存在室温(15℃~20℃),每次用完后立刻盖紧盖子,以免溶液蒸发,pH改变和污染。 - 漂洗液WB中忘记加无水乙醇
建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。 - 试剂和要回收溶液如PCR产物没有充分混匀
建议:加入每个试剂后都要充分混匀。
- 试剂盒储存在非最佳条件
- 洗脱后回收率低
- 使用了非最佳的洗脱液,洗脱液的高pH非常重要
建议:不要用水洗脱,用试剂盒带的洗脱液EB。
- 使用了非最佳的洗脱液,洗脱液的高pH非常重要
- 回收后DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
- 忘记做步骤5,乙醇抑制了酶切反应
建议:做步骤5,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。 - 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应
建议:将洗脱的回收DNA溶液13000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
- 忘记做步骤5,乙醇抑制了酶切反应
- 纯化的DNA产物OD260数值异常偏高
- 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了分光光度计读数
建议:将洗脱的回收DNA溶液13000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
- 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了分光光度计读数
- 洗脱液中不含DNA
- 在初始处理材料中没有PCR产物
建议:开始回收前,用琼脂糖凝胶/EB电泳检测PCR产物。
- 在初始处理材料中没有PCR产物
- 回收后DNA的浓度太低
- 起始的处理材料中DNA含量太低
建议:加大处理量和减少洗脱液的体积,但注意不要少于30μL。 - 回收的片段小于100bp或者大于10kb
建议:片段小于100bp或者大于10kb回收效率都会迅速降低,可尝试提高起始处理量。
- 起始的处理材料中DNA含量太低
- 回收产量不高
- 使用的结合液的量不足
建议:确保PCR产物体积和结合液的比例是1:5,PCR覆盖的油、蜡、上样液的颜料并不影响回收过程。 - 洗脱不完全
建议:可使用2次洗脱缓冲液EB洗脱(每次30μL),合并两次洗脱液。
- 使用的结合液的量不足
关于平衡液的使用
- 介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。
- 使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μL的平衡缓冲液至柱子中。13000rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。
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