产品目录

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合破壁酶特异消化酵母细胞壁，能快速从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后，加入破壁酶去除细胞壁后，然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速，方便。
  
• 获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

• RNase A保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输，收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，长期保存放-20℃。
  
• 第一次使用时，可将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液YP1后（终浓度100μg/mL）置于4℃可保存3个月左右。如果溶液YP1中RNase A时间较久失活了，提取的质粒可能有微量RNA残留，在溶液YP1中补加RNase A即可。
  
• 环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出，出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟即可恢复澄清，重新混匀，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

• 配制方法：在600mL去离子水里面溶解182.2g山梨醇，加入200mL Na2EDTA(0.5M,pH8.0)，不需要调节PH值，定容到1L，4℃保存。临用前加0.1% β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。

• 所有离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到8000×g(~9000rpm)，带50mL转头的台式离心机。
  
• 通常酵母质粒拷贝数都很低，高拷贝质粒最大得率一般为每5mL培养物提取1μg左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为：1～5μL用做PCR模板；5～10μL用于转化大肠杆菌，选择高效率的感受态细胞。
  
• 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mL DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本试剂盒正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
  
• 菌体浓度检测一般OD 600值为1的时候，酿酒酵母细胞是1～2×10⁷ cells/ml，由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大，以上仅供参考。
  
• 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

• 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶中加入200mL无水乙醇、去蛋白液PE瓶中加入40mL无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入。
  
• 将RNase A全部加入溶液YP1中，混匀，每次使用后置于2～8℃保存。
  
• 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。

• 取120～200mL酵母培养的菌液加入50mL离心管，8000×g（~9000rpm），离心1min，尽可能的倒干上清，收集菌体。
  
  • 如使用50mL离心管，可以离心弃上清后，在同一个50mL管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
• 加入10mL Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；加入0.1g破壁酶（破壁酶临用前用2mL Sorbitol buffer溶解），充分颠倒混匀，37℃温育1～2小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
  
  • 如果破壁效果不好导致质粒产量过低，可以加大破壁酶用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合破壁消化的酵母可选用Lyticase或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠涡旋振荡，反复冻融等。
• 8000×g离心2min，彻底吸除上清，加7mL溶液YP1重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
  
  • 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
• 加7mL的溶液YP2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解，室温放置4～5min。
  
  • 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5min！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
• 加10mL溶液YP3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。8000×g离心10min，小心吸取上清至新管，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
  
  • 加入溶液YP3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
    
  • 如有漂浮白色沉淀，可用吸头撇开浮沫伸入液面下吸取，偶然吸到少量漂浮的白色沉淀也不影响实验结果，后续过滤漂洗过程中都会去除。
• 将上一步得到的上清中加入吸附柱DC中，8000×g离心1min，弃滤液。
  
  • 个别情况下离心机转子倾角较大，建议每次加入吸附柱的溶液体积为9mL（不超过，以防产生漏液现象）。直到所有混合溶液通过此吸附柱。
• 加入10mL去蛋白液PE（请先检查是否已加入无水乙醇!），8000×g离心1min，弃滤液。
  
• 加入10mL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），8000×g离心1min，弃滤液。再加入10mL漂洗液WB，重复漂洗一次，弃滤液。
  
• 将空吸附柱放回收集管中，8000×g离心3min以干燥基质膜上残留乙醇。
  
  • 该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并降低洗脱效率，降低质粒产量。
• 将吸附柱置于新的50mL离心管中，室温晾干2～3min，在吸附膜的中间部位加1mL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65～75℃水浴中预热可提高产量），室温放置2min，8000×g离心1min，弃吸附柱。
  
  • 推荐：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置1min，8000×g离心1min。洗脱两遍可提高浓度约10%。
    
  • 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量（最小不应少于0.6mL）。