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无内毒素质粒中量提取试剂盒(50~70mL)图片
产品货号:
ALH083
中文名称:
无内毒素质粒中量提取试剂盒(50~70mL)
英文名称:
Plasmid Midi Kit(50-70mL)
产品规格:
20T|40T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本试剂盒适用于中量高纯或者转染级质粒制备和BAC/PAC大型质粒制备。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右,得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在1.5mL小离心管中操作,方法简单,不需特殊设备,无需过柱,不用酚氯仿抽提。



本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA,采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂,只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质,获得高质量的质粒DNA。




  • 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。
  • 快速、方便从50~70mL大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中,可快速提取150μg~600μg纯净的高拷贝质粒DNA,提取率达80~90%。
  • 获得的质粒产量高,浓度高,超螺旋比例高,纯度好,可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
  • 内毒素含量极低(<0.1 EU/μg DNA),可直接应用于细胞转染,转染效果好。
  • 本方法提取纯化质粒DNA,对质粒损伤小,即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒,只要碱裂解法能够提取,就可以有效纯化。



组分20T40T保存
RNase A(10mg/mL)0.75mL1.3mL-20℃
溶液P165mL130mL4℃
溶液P250mL100mL室温
溶液PⅢ50mL110mL室温
杂质清除剂A1.5mL3mL室温
杂质清除剂B15mL30mL室温
内毒素清除剂5mL10mL-20℃

保存:室温,有效期12个月,其中RNase A和内毒素清除剂需置于-20℃保存。


  • 第一次使用时,将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后(终浓度100μg/mL)置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活,提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留,在溶液P1中补加RNase A即可。
  • 内毒素清除剂在4℃可保存一个月,如果要长期保存,建议保存在-20℃!
  • 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
  • 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子



  • 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。
  • 提取大质粒时操作动作要轻柔,应该使用剪大了开口的吸头,防止机械剪切对DNA的损坏。
  • DNA沉淀液沉淀离心后,可能看不到明显沉淀。如未见沉淀,担心DNA丢失,可保留上清液,待完成全部操作后电泳鉴定,以确定是否获得终产物。
    • 数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上,可能无法看到明显团块。
  • 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mL DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本试剂盒正常操作情况下基本超螺旋可以超过95%。
  • 质粒DNA确切分子大小,必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道确切大小。



将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,使用后置于2~8℃保存。


  • 取过夜培养菌40~60mL(最大不超过90mL)菌液,装入50mL离心管中,4500~6000×g于4℃离心5min沉淀菌体(也可12000×g离心2分钟),完全弃除上清。
  • 加入2.5mL溶液P1,充分混悬震荡菌体沉淀,使其完全分散开,至无絮块存在。室温放置3~5min。
    • 如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
  • 加入2.5mL溶液P2,轻轻颠倒离心管6~8次,室温放置5min,使细菌完全裂解,溶液透明。
    • 温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
  • 加2.5mL溶液PⅢ,立即颠倒离心管6~8次,充分混匀,至白色絮状物产生。上述裂解液于4℃ 12000~16000×g离心10~15min,小心吸出上清,移入新的50mL离心管中。
    • 加入溶液PⅢ后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。
    • 使用异丙醇沉淀,蛋白杂质和盐离子共沉淀较少,可能看不到明显的较大团块沉淀,但是质粒还是可以完全沉淀下来,不影响实际的质粒产量。如果你习惯看见较大的沉淀团块操作,可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。
  • 加入5mL异丙醇,颠倒离心管,充分混匀。
  • 于4℃ 12000~16000×g离心10min,小心弃去上清,倒置于吸水纸上轻轻沥干残余液体,加入3~5mL 70%乙醇漂洗一遍,最高速离心5分钟,弃上清,晾干沉淀。
    • DNA沉淀如果干燥过头,DNA将无法完全溶解,但是如果乙醇没有晾干挥发干净,残留太多,也会造成DNA无法完全溶解。
    • 异丙醇离心沉淀后,质粒纯度很高吸附在管底和侧壁可能看不见沉淀,但是不影响产量,后续步骤仔细吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗溶解质粒。
  • 加入0.7mL溶液P1 完全溶解沉淀团块,注意附着在管底和侧壁上的质粒沉淀虽然可能看不见,也要吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗下来(大质粒可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。然后将质粒溶液转入1个新的1.5mL离心管中。
    • 可选步骤(一般不需要):如果菌株RNA丰富有微量RNA残留,可在此步骤后将质粒溶液60℃孵育15min消化RNA。
  • 加入55μL杂质清除液A,颠倒充分混匀后加入约 0.1体积(约80μL)冰预冷的内毒素清除剂,颠倒旋转7~10次(30秒左右)充分混匀,冰浴或者冰上放置>=5分钟,中间偶尔颠倒混匀几次。
    • 内毒素清除剂加入上清后,上清会变得浑浊,但是冰浴后应恢复清亮。
    • 如果不需要去内毒素用于转染,可在此步骤只加入55μL杂质清除液A,充分混匀后冰上放置5分钟,离心后小心取上清转入一个新管,直接接步骤11。
  • 42℃水浴,溶液又会变为浑浊,颠倒混匀后42℃温育5分钟。
  • 室温14000×g离心5min分相(温度低时,内毒素清除剂无法分相,因此必须至少20℃以上室温离心或者保证冬季转头温度20℃以上)。上层水相含DNA,下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到蓝色油状层,里面含内毒素等杂质),弃油状层。
    • 溶液必须分为上下两相,否则应重复步骤9~10。
  • 将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B(约750μL),轻柔混匀,4℃ 14000×g离心10min,弃上清(注意不要丢失DNA),轻轻加入1mL 70%乙醇洗涤,离心弃上清,共两次,室温倒置晾干5~10min使乙醇完全挥发。
  • 加适量TE或者纯水(50~100μL)溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡以辅助溶解)。
    要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上,即使看不见,也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。
    • 最后沉淀可以根据需要选择任意小体积溶解,这样可以得到很高浓度的转染级质粒DNA(高达5~10μg/μL)。如果有需要,客户也可以选择更大体积溶解。

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