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本产品是一种经过我们多次实验证实、可以用于DNA oligo退火的缓冲液。该退火缓冲液不仅可以用于常规的DNA oligo的退火，而且特别适合于较难退火的用于RNAi(也称siRNA)质粒构建的DNA oligo的退火。用于RNAi质粒构建的DNA oligo通常由于含有约20个左右的互补序列，极易自身形成发夹结构，从而影响两条DNA oligo的正确退火。本产品可以有效避免DNA oligo自身形成发夹结构，并且两条oligo退火后可以直接和经酶切、纯化的质粒连接。通常转化后可以得到大量的阳性克隆。

组分	规格
DNA寡核苷酸退火缓冲液(5X)	1mL
说明书	1份

保存：-20℃，有效期一年。


如果一次退火反应体积为100μL，一个包装的退火缓冲液可以进行50次退火反应。


DNA寡核苷酸退火缓冲液(5X)只适合于DNA oligo的退火，不能用于RNA oligo的退火。

• 把待退火的DNA oligo用经灭菌的Milli-Q水或重蒸水配制成50μM。溶解DNA寡核苷酸退火缓冲液(5X)，混匀备用。
  
• 如下设置退火反应体系：
  

  成分	用量
  Nuclease-Free Water	40μL
  DNA寡核苷酸退火缓冲液(5X)	20μL
  DNA oligo A (50μM)	20μL
  DNA oligo B (50μM)	20μL
  总体积	100μL

  
  按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。如果所用的PCR仪没有热盖，滴加矿物油以防止蒸发。
  
• 如下设置PCR仪进行退火反应：
  

  步骤	温度	时间	说明
  1	95℃	2分钟	让oligo充分变性
  2	每8秒下降0.1℃，降至25℃(注1)	约90分钟	退火
  3	4℃	长时间保持	暂时存放

  
  注1：每8秒下降0.1℃，降至25℃的程序设置，以Bio-Rad的T100为例为：1.95℃,2:00;2.95o,0.08,-0.1℃ per cycle;3.GOTO step 2,700X;4.4℃,∞。
  注2：如果所用的PCR仪不具备下降0.1℃的功能，也可以设置为每90秒下降1℃。程序设置以Bio-Rad的T100为例为：1.95℃,2:00;2.95℃,1:30,-1℃ per cycle;3.GOTO step 2,70X;4.4℃,∞。
  注3：如果条件有限，也可以将水浴锅加热至95℃，把PCR管放在水浴锅中，或者把煮沸的热水加入到保温杯或保温瓶中，待水温降到95℃时放入PCR管。所用水量控制在1～2小时内自然降温至25℃左右。此方法的退火效果可能会比使用PCR仪略差一些。
  
• 退火结束后可以直接用于连接反应，也可以在-20℃冻存备用。如果退火结束后打算进行酶切等其它反应，最好用纯化试剂盒进行纯化，或者确保退火产物在反应体系中体积不超过5%，以避免Annealing Buffer对后续的酶反应体系的干扰。

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