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pUCm-T载体图片
产品货号:
YT441
中文名称:
pUCm-T载体
英文名称:
pUCm-T Vector
产品规格:
20次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

pUCm-T载体(pUCm-T Vector)是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片段的重组克隆。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3'端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体,载体每条链的3'端带有一个突出的T。这样,pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中,形成含有目的片段的重组载体。



pUCm-T载体是在pUC19载体的基础上改造而成,除多克隆位点外,其余序列同pUC19(GenBank Accession Number:M77789)。



少量自连的载体转化得到的克隆由于编码了LacZ基因,而在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。大部分重组的载体,由于插入片段破坏了LacZ基因,因而在IPTG/X-Gal平板上转化得到白色克隆。这样就可以通过蓝白斑非常容易地筛选出重组克隆,蓝白斑筛选结果示意图如下图。


pUCm-T载体
图1.pUCm-T载体的蓝白斑筛选结果示意图。pUCm-T载体和PCR产物片段进行连接,转化后在IPTG/X-Gal平板的上长出的克隆,其中白色克隆代表PCR产物片段可能插入到pUCm-T载体中,但后续还需要酶切、PCR或者测序确认。


Base pairs2773
Lac Z promoter142-171
M13/pUC Reverse Primer204-221
Lac Z222-534
Multiple cloning region233-376
M13/pUC Sequencing Primer378-395
Synthetic Beta-lactamase (Ampr) coding region972-1832
ColE1 origin of replication(rep)1987-2606



组分规格
pUCm-T载体20μL
说明书1份

保存:-20℃


pUCm-T载体图谱


pUCm-T载体的多克隆位点的详细序列如下(请特别注意其中的Pst I不是单酶切位点):
pUCm-T载体详细图谱


  • pUCm-T载体中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pUCm-T)包括:
    Afl IIAge IApa IAsc IAvr IIBbs IBbv IIBcl I
    Blp IBsaA IBseR IBsg IBsiC IBsiW IBsm IBsmF I
    Bsp120 IBspM IIBsrG IBssH IIBst1107 IBstB IBstE IIBstX I
    Bsu36 IDra IIIEco47 IIIEco72 IEsp IFse IHpa IMlu I
    Msc IMun INae INgoM INhe INru INsi IPflM I
    Pme IPml IPpuM IPspA IRsr IISac IISfi ISma I
    SnaB ISpe ISpl ISrf IStu IXca IXma I

  • pUCm-T载体中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pUCm-T once)包括:
    HinD IIIA`AGCT,T234Acc65 IG`GTAC,C360
    BspM IACCTGC 10/14239Asp718G`GTAC,C360
    Sph IG,CATG`C244Kpn IG,GTAC`C364
    Sal IG`TCGA,C252Ban IIG,RGCY`C370
    Acc IGT`MK,AC253Sac IG,AGCT`C370
    HinC IIGTY|RAC254Apo IR`AATT,Y372
    Hind IIGTY|RAC254EcoR IG`AATT,C372
    Xba IT`CTAG,A258Kas IG`GCGC,C533
    Ava IC`YCGR,G264Nar IGG`CG,CC534
    PaeR7 IC`TCGA,G264Ehe IGGC|GCC535
    Xho IC`TCGA,G264Bbe IG,GCGC`C537
    BamH IG`GATC,C270EcoO109 IRG`GNC,CY780
    BsaB IGATNN|NNATC275Aat IIG,ACGT`C841
    Bgl IIA`GATC,T276Ssp IAAT|ATT955
    Xcm ICCANNNN,N`NNNNTGG289Xmn IGAANN|NNTTC1160
    Tth111 IGACN`N,NGTC293Bsp1286 IG,DGCH`C1177
    Not IGC`GGCC,GC305Sca IAGT|ACT1279
    Eag IC`GGCC,G305EcoN ICCTNN`N,NNAGG1399
    Xma IIIC`GGCC,G305Cfr10 IR`CCGG,Y1675
    Dsa IC`CRYG,G312Bsa IGGTCTC 7/111694
    Nco IC`CATG,G312Ahd IGACNN,N`NNGTC1760
    Sty IC`CWWG,G312AlwN ICAG,NNN`CTG2239
    EcoR VGAT|ATC320Afl IIIA`CRYG,T2648
    Cla IAT`CG,AT325Sap IGCTCTTC 8/112765



  • 对于重组的质粒可以使用载体多克隆位点上的两个PstI酶切位点进行PstI单酶切鉴定,也可以使用廉价且高效的EcoRI、BamHI、XbaI、HindIII等内切酶进行双酶切鉴定。
  • 构建完成的质粒可以通过质粒上的正反两个M13引物位点进行测序或通过T7 promoter上的T7引物位点进行测序。
  • 构建完成的质粒可以利用T7 RNA polymerase promoter进行体外转录,用于探针标记等。
  • DNA聚合酶是否可以在PCR产物3'端加A需参考该DNA聚合酶的说明。对于PCR产物为平端的情况,不适合用于T载体的连接反应。对于平端的PCR产物可以先进行在3'端加A的反应,再用T载体进行克隆。
  • 进行PCR产物克隆时需自备连接、转化等相关试剂、试剂盒。



  • PCR产物纯化:
    • PCR产物可以通过PCR纯化试剂盒或凝胶回收试剂盒(例如百奥莱博的YT009 PCR纯化试剂盒或YT010 DNA凝胶回收试剂盒)进行PCR产物纯化。对于PCR产物条带不是非常单一的情况,宜采用电泳后DNA凝胶回收的纯化方法,这样可以去除PCR扩增出来的非特异性条带的干扰。
  • 连接反应:
    • 对于常规的DNA ligase连接反应,请参考下面的连接反应体系,或按DNA ligase的说明书进行操作。每个连接反应使用1μL pUCm-T载体,约0.2pmol PCR产物,在20μL连接体系中16℃连接过夜。
      成分用量
      Sterilized Waterx μL
      10×T4 DNA Ligase Buffer2μL
      Purified PCR Producty μL
      pUCm-T Vector1μL
      T4 DNA Ligase (5~10U/μL)1μL
      总体积20μL

    • 对于快速连接试剂盒,请参考相应说明书进行连接反应。pUCm-T载体的用量还是为1μL,PCR产物的推荐用量约为0.2pmol。实际做连接反应时对PCR产物的使用量没有必要严格定量,根据PCR产物的亮度大致加入适量的PCR产物进行连接反应即可获得比较理想的连接效果。连接反应中使用的水尽量使用Milli-Q级纯水,或使用双蒸水或三蒸水。
  • 转化和筛选阳性克隆:
    按照常规方法进行转化和蓝白斑筛选。转化可以采用百奥莱博的超级感受态细菌制备试剂盒(货号:YT023)。蓝白斑筛选所需的IPTG(货号:YT430)和X-Gal(货号:YTB6192)可以向百奥莱博购买。对于白斑可以进行酶切鉴定,通常酶切鉴定正确后可以进行测序鉴定。

相关搜索:pUCm-T载体pUC19载体pUCm-T Vector
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