产品货号:
YT441
中文名称:
pUCm-T载体
英文名称:
pUCm-T Vector
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pUCm-T载体(pUCm-T Vector)是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片段的重组克隆。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3'端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体,载体每条链的3'端带有一个突出的T。这样,pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中,形成含有目的片段的重组载体。
pUCm-T载体是在pUC19载体的基础上改造而成,除多克隆位点外,其余序列同pUC19(GenBank Accession Number:M77789)。
少量自连的载体转化得到的克隆由于编码了LacZ基因,而在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。大部分重组的载体,由于插入片段破坏了LacZ基因,因而在IPTG/X-Gal平板上转化得到白色克隆。这样就可以通过蓝白斑非常容易地筛选出重组克隆,蓝白斑筛选结果示意图如下图。
图1.pUCm-T载体的蓝白斑筛选结果示意图。pUCm-T载体和PCR产物片段进行连接,转化后在IPTG/X-Gal平板的上长出的克隆,其中白色克隆代表PCR产物片段可能插入到pUCm-T载体中,但后续还需要酶切、PCR或者测序确认。
Base pairs | 2773 |
Lac Z promoter | 142-171 |
M13/pUC Reverse Primer | 204-221 |
Lac Z | 222-534 |
Multiple cloning region | 233-376 |
M13/pUC Sequencing Primer | 378-395 |
Synthetic Beta-lactamase (Ampr) coding region | 972-1832 |
ColE1 origin of replication(rep) | 1987-2606 |
组分 | 规格 |
pUCm-T载体 | 20μL |
说明书 | 1份 |
保存:-20℃
pUCm-T载体的多克隆位点的详细序列如下(请特别注意其中的Pst I不是单酶切位点):
- pUCm-T载体中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pUCm-T)包括:
Afl II Age I Apa I Asc I Avr II Bbs I Bbv II Bcl I Blp I BsaA I BseR I Bsg I BsiC I BsiW I Bsm I BsmF I Bsp120 I BspM II BsrG I BssH II Bst1107 I BstB I BstE II BstX I Bsu36 I Dra III Eco47 III Eco72 I Esp I Fse I Hpa I Mlu I Msc I Mun I Nae I NgoM I Nhe I Nru I Nsi I PflM I Pme I Pml I PpuM I PspA I Rsr II Sac II Sfi I Sma I SnaB I Spe I Spl I Srf I Stu I Xca I Xma I - pUCm-T载体中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pUCm-T once)包括:
HinD III A`AGCT,T 234 Acc65 I G`GTAC,C 360 BspM I ACCTGC 10/14 239 Asp718 G`GTAC,C 360 Sph I G,CATG`C 244 Kpn I G,GTAC`C 364 Sal I G`TCGA,C 252 Ban II G,RGCY`C 370 Acc I GT`MK,AC 253 Sac I G,AGCT`C 370 HinC II GTY|RAC 254 Apo I R`AATT,Y 372 Hind II GTY|RAC 254 EcoR I G`AATT,C 372 Xba I T`CTAG,A 258 Kas I G`GCGC,C 533 Ava I C`YCGR,G 264 Nar I GG`CG,CC 534 PaeR7 I C`TCGA,G 264 Ehe I GGC|GCC 535 Xho I C`TCGA,G 264 Bbe I G,GCGC`C 537 BamH I G`GATC,C 270 EcoO109 I RG`GNC,CY 780 BsaB I GATNN|NNATC 275 Aat II G,ACGT`C 841 Bgl II A`GATC,T 276 Ssp I AAT|ATT 955 Xcm I CCANNNN,N`NNNNTGG 289 Xmn I GAANN|NNTTC 1160 Tth111 I GACN`N,NGTC 293 Bsp1286 I G,DGCH`C 1177 Not I GC`GGCC,GC 305 Sca I AGT|ACT 1279 Eag I C`GGCC,G 305 EcoN I CCTNN`N,NNAGG 1399 Xma III C`GGCC,G 305 Cfr10 I R`CCGG,Y 1675 Dsa I C`CRYG,G 312 Bsa I GGTCTC 7/11 1694 Nco I C`CATG,G 312 Ahd I GACNN,N`NNGTC 1760 Sty I C`CWWG,G 312 AlwN I CAG,NNN`CTG 2239 EcoR V GAT|ATC 320 Afl III A`CRYG,T 2648 Cla I AT`CG,AT 325 Sap I GCTCTTC 8/11 2765
- 对于重组的质粒可以使用载体多克隆位点上的两个PstI酶切位点进行PstI单酶切鉴定,也可以使用廉价且高效的EcoRI、BamHI、XbaI、HindIII等内切酶进行双酶切鉴定。
- 构建完成的质粒可以通过质粒上的正反两个M13引物位点进行测序或通过T7 promoter上的T7引物位点进行测序。
- 构建完成的质粒可以利用T7 RNA polymerase promoter进行体外转录,用于探针标记等。
- DNA聚合酶是否可以在PCR产物3'端加A需参考该DNA聚合酶的说明。对于PCR产物为平端的情况,不适合用于T载体的连接反应。对于平端的PCR产物可以先进行在3'端加A的反应,再用T载体进行克隆。
- 进行PCR产物克隆时需自备连接、转化等相关试剂、试剂盒。
- PCR产物纯化:
- 连接反应:
- 对于常规的DNA ligase连接反应,请参考下面的连接反应体系,或按DNA ligase的说明书进行操作。每个连接反应使用1μL pUCm-T载体,约0.2pmol PCR产物,在20μL连接体系中16℃连接过夜。
成分 用量 Sterilized Water x μL 10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL Purified PCR Product y μL pUCm-T Vector 1μL T4 DNA Ligase (5~10U/μL) 1μL 总体积 20μL - 对于快速连接试剂盒,请参考相应说明书进行连接反应。pUCm-T载体的用量还是为1μL,PCR产物的推荐用量约为0.2pmol。实际做连接反应时对PCR产物的使用量没有必要严格定量,根据PCR产物的亮度大致加入适量的PCR产物进行连接反应即可获得比较理想的连接效果。连接反应中使用的水尽量使用Milli-Q级纯水,或使用双蒸水或三蒸水。
- 对于常规的DNA ligase连接反应,请参考下面的连接反应体系,或按DNA ligase的说明书进行操作。每个连接反应使用1μL pUCm-T载体,约0.2pmol PCR产物,在20μL连接体系中16℃连接过夜。
- 转化和筛选阳性克隆:
按照常规方法进行转化和蓝白斑筛选。转化可以采用百奥莱博的超级感受态细菌制备试剂盒(货号:YT023)。蓝白斑筛选所需的IPTG(货号:YT430)和X-Gal(货号:YTB6192)可以向百奥莱博购买。对于白斑可以进行酶切鉴定,通常酶切鉴定正确后可以进行测序鉴定。
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