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本试剂盒是基于同源重组原理开发的一种简单、快速、高效的无缝克隆技术，能够将任意含有载体末端重叠区域的DNA片段重组至线性化载体上，不受酶切位点限制，载体自连背景极低。该方法的实现需要在插入片段正/反向PCR引物的5’端引入线性化载体上的15～25nt末端序列，通过重组酶的作用使得具有重叠区域的片段和载体最快在50℃ 5min内重组，完成无缝克隆，可同时实现1~5个DNA片段的重组。

2×BioClone Seamless Cloning Mix Ver.3采用独特重组蛋白E-T，显著提升对DNA投入量的兼容性，对于低浓度DNA片段重组效率有着更高的效率。

• 快速：可在5～60min内完成重组。
  
• 简单：不受酶切位点的限制，无需对片段酶切。
  
• 无缝：不引入额外序列。
  
• 高效：对多片段重组有着更高的效率。

适用于1～5个片段的快速无缝克隆、定点突变和高通量克隆等实验。

• 线性化载体的制备
  选择合适的克隆区域对载体进行线性化（尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域），线性化的方法有酶切制备和反向PCR扩增制备。
  
  • 酶切制备
    推荐使用双酶切使载体线性化更完全，以降低转化背景。使用单酶切线性化载体时，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。平末端或粘末端均可，但务必保证酶切完全。
    
    • 经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，单酶切则需要去磷酸化。
      
    • 酶切完成后，应快速将内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。
      
    • 酶切后进行胶回收纯化，推荐纯化后通过琼脂糖凝胶电泳检测产物，可同时与DNA Marker比较亮度检测浓度。
  • 反向PCR扩增制备
    推荐使用高保真聚合酶扩增减少碱基突变的概率。推荐使用预线性化质粒为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。当模板为环状质粒时，扩增产物建议用Dpn I消化后使用。
    
    通过胶回收纯化PCR产物，推荐纯化后通过琼脂糖凝胶电泳检测其质量和浓度，可同时与DNA Marker比较亮度检测浓度。
• 插入片段的制备
  
  • 引物设计原则
    插入片段扩增引物由两部分构成：重叠区域+特异性引物，即在插入片段的正/反向引物的5'端引入待重组的线性化载体末端15～25nt的序列（推荐18nt，不包括酶切位点），使得扩增后的插入片段末端带有和线性化载体末端一致的同源序列。
    F正向引物(5'-3')：上游载体重叠区域+酶切位点（可选）+正向特异性引物扩增序列
    R反向引物(5'-3')：下游载体重叠区域+酶切位点（可选）+反向特异性引物扩增序列
    
    • 若载体为粘性末端，且3'端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。
      
    • 尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25nt区域内GC含量为40%～60%时，重组效率最高。
      
    • 计算扩增引物Tm值时，只需计算特异性引物的Tm值，引入的额外序列无需计算。
    示例一：单个插入片段扩增引物设计(以BamHI和Xho I双酶切线性化载体为例)
    
    
    
    示例二：多个插入片段扩增引物设计（以BamHI和XhoI双酶切线性化载体为例）
    
    
    
    
    插入多个片段时引物设计：第一片段的上游引物和第三片段的下游引物，分别按照单片段插入的方式引入载体两端的同源序列即可；片段间同源序列引物设计有三种方式：
    

    • 以前一片段3'端15～25nt作为同源序列添加至后一片段5'端(如示例二图所示)。
      
    • 以后一片段5'端15～25nt作为同源序列添加至前一片段3'端。
      
    • 两片段各取一部分作为同源序列(总计15～25nt)，分别添加至另一片段末端。
• 重组反应
  
  • 体系的配制
    

    组分	目的重组	阴性对照1③	阴性对照2④	阳性对照(可选)⑤
    2×BioClone Seamless Cloning Mix Ver.3	5μL
    线性化载体(10～200ng)①	X μL	X μL	0μL	1μL(线性pUC19对照载体)
    插入片段(10～200ng)②	Y μL	0μL	Y μL	1μL(线性插入片段对照)
    ddH2O	至10μL

    • 最适载体用量(ng)=0.02×载体碱基对数，即0.03pmol。
      
    • 最适片段用量(ng)=0.04×片段碱基对数，插入多片段，每片段最适用量(ng)=0.02×片段碱基对数。若插入单片段的长度大于载体，则应互换载体与插入片段用量；若插入片段的长度小于200bp，则插入片段应使用5倍载体用量；（推荐载体和插入片段最低投入量在10～100ng以内）
      
    • 检验线性化载体中有无背景质粒残留。
      
    • 当插入片段扩增模板是与克隆载体抗性相同的环状质粒时，推荐进行。
      
    • 用来排除其他操作因素的影响。
    • 若按上述公式计算得到的用量超过最低/最高值，则建议直接按最低/最高用量使用。
      
    • 若载体片段过长、插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。
      
    • 若某一组分浓度过高可适当稀释后使用，每个组分的用量最好不低于1μL。
  • 反应条件
    将上述各个成分轻柔混匀（避免产生气泡，请勿涡旋操作），按如下条件进行反应：
    

    插入片段	反应条件
    1～2个插入片段	50℃，5～15min
    3～5个插入片段	50℃，15～30min

    当载体骨架>10kb或插入片段>4kb时，建议延长反应时间至30～60min。
    
    • 推荐使用PCR仪等温控较精准的仪器反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低。
      
    • 50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。
      
    • 将反应管置于冰上冷却，建议即时转化。
• 转化
  
  • 取100μL冰浴上融化的感受态细胞，加入适量重组产物（体积不超过所用感受态细胞体积的1/10），轻轻混匀，冰上静置25min。
    
  • 42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。
    
  • 向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌培养基（2×YT或LB），混匀后37℃，200rpm复苏1h。
    
  • 根据实验需要，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含相应抗生素的2×YT或LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
• 阳性克隆的鉴定
  
  • 菌落/菌液PCR鉴定：用枪头挑取单菌落至10μL无菌水中混匀后取1μL为模板，或直接蘸取菌落至PCR体系中扩增（建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果）。
    
  • 以质粒为模板PCR鉴定：挑取单克隆至含相应抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜摇菌后抽提质粒作为模板，可使用载体通用引物或特异性引物扩增。
    
  • 酶切鉴定（若有需要）：挑取单克隆至含相应抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜摇菌后抽提质粒，使用相应内切酶酶切质粒后电泳检测片段大小。
    
  • 测序：建议使用载体通用引物测序鉴定。

• 克隆数少或不长克隆？
  
  • 引物设计有误。设计及合成引物时，注意反向引物的序列顺序。
    
  • 插入片段纯度差。对载体和插入片段进行胶回收纯化，电泳检测胶回收产物后再进行连接反应；不推荐多管样品过一个柱子的方式回收DNA，会造成更多的EDTA、胍盐等杂质残留，抑制反应；用于重组反应的胶回收产物请溶解于ddH2O中。
    
  • 线性化载体或插入片段比例不佳。请严格按照说明书推荐的方法计算各组分用量，用琼脂糖凝胶电泳检测样品质量及浓度。
    
  • 感受态效率低。自制感受态随着保存时间的增加，效率可能会降低，建议尽量使用新鲜感受态或高效的商业化感受态。
• 多数克隆不含插入片段？
  
  • 克隆载体及片段中含有质粒背景。酶切制备线性化载体时，提高快速内切酶的使用量，延长反应时间，使用胶回收纯化酶切产物；制备插入片段时尽量使?预线性化质粒作为扩增模板，扩增产物进行DpnⅠ消化及凝胶回收纯化。
    
  • 相同抗性质粒污染。注意实验环境的清洁及背景质粒的消除。
• 克隆含有不正确的插入片段？
  PCR产物中混有非特异性扩增。推荐优化PCR体系，提高特异性，使用凝胶回收PCR产物。
  
• 菌落PCR无条带或大小不对？
  
  • 引物不正确。推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌P鉴定。
    
  • 假阴性结果（插入片段较大）。建议提取质粒为模板进行PCR验证或酶切验证。优化PCR体系、程序。
    
  • 重组失败。只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化载体及片段质量。