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发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。MSU440发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（玉米，烟草，茶树，青蒿等），同时具有链霉素抗性。

• 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
  
• 混匀质粒时应用手指快速拨打管底或用枪吹吸混匀，务必使质粒快速、均匀分散开，与感受态细胞充分接触。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
  
• 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或降低涂板的菌量。
  
• MSU440具有链霉素抗性，不可用于具有链霉素抗性质粒的转化。

• 取-80℃保存的MSU440发根农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
  
• 每100μL感受态加入0.01～1μg质粒DNA，用手快速、剧烈拨打管底混匀或用枪吹吸混匀，依次放于冰中静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
  
  • 转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量。
• 冰浴中拿出放室温，加入700μL无抗生素的TY液体培养基，于28℃振荡培养2小时。
  
• 6000rpm离心一分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3天。

• 农杆菌相关抗生素配方：
  

  抗生素	溶剂	除菌	原液(mg/mL)	工作液(μg/mL)
  羧苄青霉素	ddH2O	0.22μm滤膜过滤除菌	50	50
  硫酸卡那霉素			50	50
  链霉素			10	50
  庆大霉素			20	40
  利福平	DMSO		10	20

• 常用农杆菌抗性：
  

  农杆菌菌株	羧苄青霉素	链霉素	利福平	庆大霉素	硫酸卡那霉素
  AGL1	R	R	R	S	S
  EHA105	S	R	R	S	S
  LBA4404	S	R	R	S	S
  GV3101	S	S	R	R	S

  R：抗；S：敏感。
  
• TY培养基配方：
  
  • 按下表加入各成分
    

    成分	用量
    Tryptone	5g
    Yeast extract	3g

  • 补水到1L体积，完全溶解后，121℃、20分钟高温灭菌。
    
  • 配制1M的氯化钙水溶液，121℃、20分钟高温灭菌。
    
  • 每1L灭菌的TY液体营养液中加入10mL无菌的1M氯化钙水溶液即可。
    
  • 若配制TY固体培养基，则加入15g琼脂粉。