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分子克隆是分子生物学领域的奠基性技术，它是利用质粒作为载体来克隆所需的DNA片段，并利用大肠杆菌作为宿主进行扩增，使DNA片段取之不尽。分子克隆技术极大促进了生物学的发展，但是，其缺点是耗时并且步骤繁多，从连接到重组子鉴定一般需要3～7天（取决于宿主细胞）。为克服此缺点，百奥莱博公司根据滚环扩增原理开发了本试剂盒。

• 即开即用，十分方便，用户不需要辛苦摸索条件。
  
• 起始材料为DNA片段-载体连接产物或DNA片段自身环化产物，到扩增产物鉴定最快只需要6小时完成（扩增4小时+酶切鉴定2小时）。如果起始DNA少，则需要更长的时间。
  
• 使用自备的DNA插入片段专一的引物，只扩增带有DNA插入片段的重组质粒，不扩增自连载体。如果连接反应时已经排除了载体自身环化，则可以使用本试剂盒提供的RCA引物。
  
• 适用于任何长度的DNA，也适用于对宿主有毒的DNA和在宿主细胞内不稳定的重复DNA。
  
• 不需要感受态细胞。
  
• 所得质粒DNA没有任何RNA、宿主DNA或内毒素的污染。
  
• 高保真，所得DNA跟分子克隆制备的DNA一样的保真率。
  
• 所得DNA可以直接用于酶切、一代和二代测序、转染和酵母转化。酶切和自身环化后还可以转化大肠杆菌。
  
• 含荧光染料，可以实时检测扩增的进行。

• 用常规方法进行插入片段和克隆载体的连接。由于本制品基于滚环扩增，故只能扩增没有切口的环状的DNA。因此在连接时，需要注意两点：一是最好通过粘性末端不同或碱性磷酸酶处理载体，防止载体自连，这样就可以使用本试剂盒提供的RCA专用随机引物，不必再合成插入片段专一的引物。二是样本中必须有一条没有任何切口，变性后还是环状单链的DNA。常规的AT克隆，由于PCR片段的两个5’端没有磷酸化，所以连接后重组质粒的四个切口其实只连接上了两个，另外两个并没有连接上。这种带切口的重组质粒并不影响转化，但不能进行RCA扩增，因为DNA变性后两条DNA链其实还是线状DNA。所以这种PCR片段需要先磷酸化，或者PCR的时候就用5端磷酸化的引物，这样连接后才能用于RCA扩增。
  
• 按下表设置10μL的环状DNA RCA反应：
  

  成分	样本	无模板对照
  连接产物(100pg)	1μL	-
  RCA专用随机引物溶液	2μL
  自备DNA插入片段专一性引物	40pmol
  dNTP-染料混合液	1.5μL
  10×Phi29 DNA聚合酶缓冲液	1μL
  超纯水	至9.5μL
  在PCR仪器上95℃ 3分钟，放室温待温度下降到常温后加入。
  phi29 DNA聚合酶(10U/μL)	0.5μL
  合计	10μL

  • 自备引物的方向跟常规PCR的方向相反，长度只要6～10个碱基即可。使用时必须跟本试剂盒提供的RCA专用随机引物共同使用。
• 放荧光定量PCR仪器上，设置30℃保温16小时，每10分钟设置成一个循环，采集一次SYBR通道的荧光信号。由于是实时检测反应，所以反应不一定要16小时后终止，可以在扩增曲线进入平台期后（已经没有新的DNA合成）提前结束。如果没有荧光定量PCR仪器，则只能电泳检测或PCR检测是否有扩增。
  
• 典型实验结果。有扩增的样本将有平缓的S荧光曲线，无模板对照将没有此标准扩增曲线（见下图）或扩增曲线：
  
  
• 65℃保温10分钟灭活phi29 DNA聚合酶。由于phi29 DNA聚合酶有很强的3-5外切酶活性，因此必须灭活，否则它将逐渐降解已经合成的DNA。
  
• 扩增所得质粒DNA为超分支结构，直接电泳就是模糊一片，并不能进行分析鉴定。因此必须先酶切再电泳。可以选择跟常规重组子鉴定一样的酶进行酶切电泳，也可以用菌落PCR一样的方法进行菌落PCR来判断是否克隆成功。扩增产物也可以直接用于转染、酵母转化、一代或二代测序。如果转化大肠杆菌，则需要先用只酶切重组质粒一次的限制性内切酶酶切，再自连，再转化。也可以用超纯水将1μL扩增产物稀释100倍后再用1μL稀释液作为模板，再进行RCA扩增，得到更多的DNA。