产品货号：
KL230328
中文名称：
大肠杆菌化学感受态细胞制备试剂盒
英文名称：
E.coli Competent Cell Preparation Kit
产品规格：
20T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本试剂盒是基于Inoue方法的、高效快速E.coli化学感受态细胞制备试剂盒。
保存：2～8℃，有效期1年。
试剂开封后请置于-20℃保存，防止污染。
无菌超纯水、SOB和SOC液体培养基、相关抗菌素、温控摇床。
本试剂盒足够20次制备，每次可以制备可以用50mL菌液制备80管感受态细胞。所得感受态细胞在-80℃至少可以保存半年以上。
一、化学感受态细胞制备
二、转化步骤
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- 一步式操作，离心后重悬细胞即可，非常简单。
- 转化率高，转化效率一般都在10E8/ug质粒以上。
- 重复性好，可用于各种E.coli菌种，包括K12系（如JM109、DH5a等）和B系（如BL21系列菌种）。
- 适用于低、中、高拷贝的各种质粒。
| 组分 | 规格 |
| 大肠杆菌化学感受态细胞制备试剂盒 | 20T |
| E.coli化学感受态细胞制备溶液A | 250mL×2 |
| E.coli化学感受态细胞制备溶液B | 6mL |
保存：2～8℃，有效期1年。
试剂开封后请置于-20℃保存，防止污染。
无菌超纯水、SOB和SOC液体培养基、相关抗菌素、温控摇床。
本试剂盒足够20次制备，每次可以制备可以用50mL菌液制备80管感受态细胞。所得感受态细胞在-80℃至少可以保存半年以上。
一、化学感受态细胞制备
- 划盘，过夜培养出单菌落。
- 次日下午，接种一个单个直径为2-3毫米的菌落到1mL不含抗生素的SOB液体培养基中，37℃ 220rpm摇晃过夜培养。
- 次日早上，将20μL上步得到的菌液接种到2mL SOB液体培养基中，37℃ 250～300rpm摇晃培养3小时。此时菌液将轻微浑浊。
- 将1mL上步得到的菌液接种到50mL SOB液体培养基中（用250mL三角瓶），用户也可以分别接种1mL，0.5mL和0.25mL到3个50mL的SOB液体培养基中，这样2～3小时测OD时总有一瓶OD会在0.3-0.4，避免了多次测OD可能带来的污染。
- 室温或18℃ 250～300rpm摇晃培养2～3小时，直到OD600在0.3～0.4之间。
- 确保室温或18℃培养非常重要，在此温度下细菌OD600达到0.3-0.4所需时间跟菌种不同而不同。
- 将菌液放置在冰上10分钟。同时预冷下步要用的50mL无菌离心管和20mL溶液A。
- 所需冷冻离心机也最好开启制冷。
- 将50mL菌液转移到2个预冷的无菌离心管中，每管25mL。在冷冻离心机上4℃ 3000g离心10分钟，弃上清。
- 必须低温离心，否则转化效率将减低100倍。
- 再在4℃ 3000g短暂离心半分钟，用移液枪小心吸出残留液体。
- 残留上清必须彻底去除，否则会影响感受态效率。
- 在沉淀中加入20mL预冷的溶液A，轻弹离心管底轻柔重悬菌体。
- 注意不要涡旋振荡。
- 冰上放置5分钟。期间预冷4.3mL新鲜配制的感受态活化液（4mL溶液A+0.3mL溶液B，充分混匀后放冰上）和装感受态细胞所需的无菌塑料离心管。
- 4℃ 3000g离心10分钟，弃上清。
- 在沉淀中加入4mL第9步预冷的感受态活化液，重悬细菌后冰上放置10分钟。
- 按50μL/管分装到预冷的无菌塑料离心管中。此时细胞将处于感受态，可以直接用于转化，也可立即放到-80℃保存。50mL菌液一次可以制备80管感受态细胞。
二、转化步骤
- 将冻存的感受态细胞置于冰中解冻。
- 加入1～5μL质粒（100pg～10ng）或1～5μL连接反应液。用加DNA的移液器轻柔吹打混匀，不要涡旋震荡。
- 冰浴15～30分钟。期间可以37℃预热1mL自备的、不含抗菌素液体培养基（此处最好用SOB，因为LB培养基将降低转化率）。
- 42℃热激60秒后冰浴1～2分钟。
- 加入1mL 37℃预热的不含抗菌素液体培养基后，37℃保温1小时。如能160～225rpm振荡培养更佳。
- 将50～100μL菌液涂布在含适当抗菌素的琼脂平板培养基上，37℃过夜培养。
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