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本试剂盒是利用拓扑异构酶(Topoisomerase)高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成，包含TOP10感受态细胞在内的全套试剂盒，更加便于用户进行TOPO-TA克隆。

• 快速：仅需5分钟即可完成连接反应；
  
• 高效：无自连现象，阳性克隆率极高，无需设置蓝白斑筛选。

• 实验准备。
  
  • LB培养基等。
    
  • 带A尾PCR产物：常规Taq DNA聚合酶等扩增的PCR产物带A尾。建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验，可以使用柱式DNA胶回收试剂盒。如果PCR扩增产物特异性很高，可直接使用柱式PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。
• 在冰浴的PCR管中配制下列连接体系。
  

  成分	用量
  10×Enhancer	1μL
  带A尾PCR产物 或1kb Control Insert(40ng/μL)	0.5～8μL
  pUCI-T克隆载体(30ng/μL)	1μL
  无菌ddH2O	至10μL

  • 可根据具体实验情况按照上述比例调整反应体系。
    
  • 插入DNA片段不能磷酸化。
• 室温(20～30℃)连接5分钟。
  
  连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5分钟，一般1～2分钟即可完成连接反应，得到足够的重组子。
  
  
• 将100μL感受态细胞置于冰上解冻后，加入上述10μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟。
  
  加入体积不超过感受态细胞体积的1/10。
  
  
• 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中放置2分钟左右，注意不要晃动。
  
• 加入500μL不含抗生素的无菌培养基，37℃振荡培养1小时。
  
• 5000rpm离心2分钟，用枪头吸掉350μL上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
  
• 将细菌悬液均匀涂布在氨苄青霉素抗性的LB平板上。37℃倒置培养过夜。
  
  涂布菌液的用量可以根据连接的效率及感受态细胞的转化效率而进行适当的调整。
  
  
• 转化子的筛选鉴定。
  
  • 用牙签挑取白色菌落，以试剂盒自带引物M13F/R进行PCR检测或测序确定是否含有目的克隆，或将白色菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基中37℃培养过夜，提取质粒后进行PCR或酶切鉴定。
    
  • 克隆子只适用于试剂盒提供的M13引物进行菌落PCR验证。
    
  • 本制品阳性率相当高，一般情况下，阳性克隆率接近100%，只要菌落正常(不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少)，基本就是阳性克隆，因此插入片段不超过2kb的情况下可以不用鉴定直接挑1～2个菌去测序。

• PCR产物的纯度
  
  • 连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。不经纯化的PCR产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。
    
  • PCR产物不能被磷酸化，常规引物的5'端是羟基，可用于该实验，引物不能进行5'端磷酸化修饰。
• 载体的摩尔比和优化插入片段
  
  • 推荐插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用0.5~15:1的连接比例也可成功进行连接。如果你的PCR产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。
    
  • 不同的插入片段所用量参考下表
    

    插入片段大小	推荐用量
    0.1～1kb	20～50ng
    1～2kb	50～100ng