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PCR产物T载体克隆试剂盒图片
产品货号:
GS2273
中文名称:
PCR产物T载体克隆试剂盒
英文名称:
PCR Product Cloning Kit
产品规格:
20次|100次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本试剂盒适用于克隆带有3’末端A突出的的PCR产物。本试剂盒提供的独特连接系统允许用户在1~2小时内的时间里完成连接反应。


本公司的pUCm-T载体是为简化PCR产物的克隆而设计的。许多热稳定的DNA聚合酶,如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3’末端后都带有一个突出的碱基A,这样的PCR产物很容易连接到带有突出碱基T的T载体上。


pUCm-T载体是一种新颖的pUC系列T载体,其多克隆位点大多是单切点,以及β-半乳糖苷酶读码框的调整,大大方便了克隆的蓝/白筛选。插入位点两端独特设计的两个PstI位点使插入片段可以用Pst I单酶切进行检测,也可以用非常廉价而高效的EcoR I和Hind III双酶切进行检测。可以用M13通用引物和T7启动子引物对PCR产物进行测序。pUCm-T含有T7 RNA聚合酶的启动子,可以对插入片段进行体外转录。


本说明书末列出了pUCm-T相关的技术资料,其全序列可参照pUC19(GenBank Accession Number M77789),只是其多克隆位点部分的序列有所不同。




组分20T100T
pUCm-T vector1μg5μg
10×Ligation Buffer50μL200μL
50% PEG400050μL200μL
T4 DNA Ligase(5U/μL)100U500U
Sterilized ddH2O1mL1mL

保存:-20℃


  • 连接反应的准备:

    PCR产物是否需要纯化取决于扩增产物的质量。如果PCR产物特异性很高,则不需要对产物进行纯化。但是如果将质粒作为模板,则需要对PCR产物进行纯化,因为质粒模板在转化后会形成白色的菌落。PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。本公司的PCR产物胶回收试剂盒(B610353)可有效回收>60bp的DNA片段。

    Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物会在3’末端添加碱基A。Taq DNA聚合酶同具有3'→5'外切酶活性的Pfu、Pwo、Tli或Deep vent DNA聚合酶共同扩增的产物也可能会在3’末端添加碱基A。PCR产物3’端含有突出的碱基A可以被连接到pUCm-T上。具有3’?5’外切酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物为平末端,克隆这样的片段需要在平末端加A。

  • 连接反应:
    • 在一个标准的10μL连接反应体系中,加入50ng (1μL) pUCm-T vector、0.2pmol PCR产物、1μL 10×ligation Buffer和1μL T4 DNA Ligase,并加入ddH2O至终体积为10μL,通常不需要对PCR产物进行定量。连接反应体系可根据如下进行配制:
      成分用量
      10×Ligation Buffer1μL
      50%PEG1μL
      pUCm-T vector1μL
      纯化的PCR产物X μl
      Sterilized waterY μl
      T4 DNA Ligase1μL
      总体积10μL
      注:T4 DNA Ligase最后加。
    • 16~23℃连接1h~过夜。
      注:常规实验1h已足够。
  • 转化:
    • 将100μL感受态细胞冰上解冻,完全溶解后轻轻混匀。
    • 加入5μL上述连接液,轻轻混匀,冰上放置30min。
    • 42℃水浴热激1.5min。再在冰上放置2~10min。
    • 加入400μL LB培养基,37℃ 200~250rpm振荡培养1h。
    • 4000rpm离心5min,用枪头吸掉400μL上清液,用剩余的培养基将细胞重悬。
    • 将细菌悬液均匀涂布在含有20μL IPTG(100mM)和100μL X-gal(20mg/mL)的氨苄青霉素抗性的LB平板上。
      注:使用细菌的数量取决于连接和转化的效率。
    • 将平板在37℃正向放置1小时后吸掉过多的液体,倒置培养过夜。
  • 筛选
    通过蓝/白斑筛选转化子
    当外来DNA片段被克隆进pUCm-T时,LacZ基因读码框的编码序列被插入的外来DNA改变,因此a-序列的活性被影响,重组克隆可在X-gal/IPTG平板上通过颜色进行筛选,未发生重组克隆的菌落为蓝色。用牙签挑选IPTG/X-gal平板上的白色菌落,转移到含Amp+的液体培养基37℃过夜培养。
  • 转化子的鉴定
    • 从含白色菌落的液体培养基中提取质粒,用PstI或其它合适的限制性内切酶酶切质粒,检测插入片段的大小,以证明该菌落是否含有目的片段。
    • 克隆的目的片段可使用M13通用引物或其它合适的引物进行测序,进一步证明该菌落含有目的片段。



  • pUCm-T载体图谱
    pUCm-T载体
  • UCm-T载体启动子和多克隆位点序列
    pUCm-T载体
  • pUCm-T载体的酶切位点
    • 不切割pUCm-T载体的限制性内切酶
      AcaIAccIIIAceIIAfa24RIAgeIAmaIAosIIIApaIApeIAscI
      Asp78IAtuCIAvaIIIAvrIIBaeIBalIBbf7411IBbsIBclIBco102II
      BfrBIBlpIBmgIBplIBpu10IBpu1268IBsaAIBsaFIBsaKIBsaMI
      BscEIBscJIBse59IBseRIBsgIBsiWIBsmFIBsmGIBsp120IBsp87I
      BspGIBspLU11IIIBsrGIBssHIIBst1107IBst29IBst98IBstEIIBstXIBsu36I
      CfrAICspICsp45IDraIIIDrdIIEciAIEciEIEco47IIIEco72IEcoAI
      EcoBIEcoDIEcoDXXIEcoDR3EcoEIEcoNIEcoR124IEcoR124IIEcoRD3FinI
      FseIHpaIMluIMlu1106IMlu113IMsp20IMunINaeINgoMINheI
      NruINsiIPacIPauIPfuIPmeIPpu10IPpu6IPpuMIPshAI
      RleAISacIISanDISfiISgfISgrAISmaISnaISnaBISpeI
      SrfISse8647IStuIStySQSwaIUba1220IUba1221IUba1382IUbaDIVan91I
      XmaI
    • 切割pUCm-T载体一次的限制性内切酶
      AacI497AteI455BsbI117Eco52I463KasI235SphI532
      AatII2708AvaI504BshLI449Eco82I395KpnI412Sse8387I526
      AccI517BamHI498BsoDI462EcoDR2397NarI236SspI2590
      Acc65I408BanII406Bsp117I401EcoICRI404NcoI456StyI456
      AcrI503BbeI239BspJ106I407EcoKI2443Nli387/7I508StySJ158
      Acs1371I515BbeAI234BspLU11I893EcoO109I2762NotI463StySPI2443
      AflIII893BbrI534BspMI529EcoRI396Pfl1108I1801SynII2380
      AflIV2263BcgI2291Bst224I455EcoRV452Ppu1253I2703Tth111I478
      AhyAI503BcgI2325Cfr10I1866EcoprrI541PssI2765Tth111II1490
      AlwNI1309Bco63I492ChuII515EheI237SacI406Uba13262760
      ApaBI186BglII492ClaI445Esp16I50SalI516XbaI510
      ApoI396Bli49I1852DsaI456Esp3I45SapI777XcmI484
      Apu16I443BsaI1847DsaVI515FsuI474ScaI2266XhoI504
      Asp52I533BsaXI756Ecl137I401HincII518SciI506XmnI2385
      Asp5HI527BsaBI497EclHKI1786HindIII534SexAI476

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