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本载体采用了定向拓扑异构酶克隆技术（Directional Topoisomerase Cloning）可以在5分钟内将待表达目的基因（高保真酶扩增的平末端片段）一步法定向克隆到高效pET增强型载体，利用T7lac启动子进行严谨调控，高效表达。

• 简单快速，加入待表达基因片段室温仅需5分钟便可完成原核表达载体构建。
  
• 定向克隆技术，超过90%插入为正确方向插入，减少克隆筛选耗费的时间。
  
• T7lac启动子严谨调控本底表达，实现表达过程的可控和高效表达。
  
• 氨苄抗性标记筛选，N端和C端6?His标签方便表达后纯化。
  
• 带肠激酶(EK)酶切位点，可以方便将标签切除得到不带标签的蛋白。

• 待表达目的基因扩增引物设计原则：
  
  • 为了达到定向克隆的目的，上游引物5'端应该加上额外的4个碱基CACC，这样PCR产物的5'端可以和载体上突出的GTGG互补配对，从而达到定向克隆的目的。
    举例：
    待表达序列：5'-ATG GGA TCT GAT AAA...
    设计上游引物：5'-CACC ATG GGA TCT GAT AAA...
    
  • 如仅需在N端加上6×His-tag，则下游引物的起始端应该加上终止密码子（密码子序列应该为反向互补序列，例如终止密码子是TGA，那么下游引物起始为TCA）
    
  • 如需在N端和C端同时加上6×His-tag，则下游引物的起始端应该不包含终止密码子；为达到定向克隆的目的，下游引物5'起始应该不包含CACC，这样可以避免PCR产物的3'端也可以和载体上突出的GTGG互补配对而造成错误方向的插入。
• 连接反应的准备：
  PCR引物不能磷酸化。使用扩增产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增（如Pfu、Vent、Phusion DNA Polymerase）。PCR产物（仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体）可直接进行连接反应，无需纯化，否则建议胶回收纯化。如果是以质粒为模板的PCR产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。
  
• 连接反应：
  
  • 室温（25～37℃）设立10μL连接体系（建议用0.2mL PCR管，PCR仪器控温）：
    

    成分	用量
    纯化后的PCR产物	0.5～8μL
    pTOPO-D1 Vector	1μL
    10×Enhancer	1μL
    灭菌水	至10μL

    加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（20℃～30℃）进行。
    不同大小插入片段的推荐用量：
    

    插入片段大小(bp)	最佳用量(ng)
    100～1000	20～40
    1000～2000	30～70
    2000～5000	50～100

  • 室温（25℃～37℃）连接5分钟。
    
    • 本载体推荐室温5分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到15分钟，温度可选37℃，可显著增加转化子数量。
  • 连接产物可直接转化克隆感受态细胞（如DH5a，TOP10等）或贮存于-20℃。
    
    • 如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。
• 转化：
  
  • 50～100μL感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后（约1分钟左右）轻掸几次将细胞均匀悬浮。
    
  • 加入5μL连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀，室温放置5分钟。
    
    • 根据我们的经验，本公司载体使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5分钟便可获得足够多转化子，如果实验室自制感受态细胞或者效率较低时，可以按照标准程序进行。
  • 加300～500μL LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 180rpm振荡培养60分钟。
    
    • 根据我们的经验，一般可以直接将培养基（事先平衡至室温）加入感受态细胞的1.5mL离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。
  • 取200μL菌液涂板，培养过夜。
    
    • 如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000rpm离心1min，吸弃掉部分上清，保留100～150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板。
• 转化子的筛选鉴定：
  
  • 菌落PCR检测/提取质粒内切酶酶切鉴定阳性克隆。
    
  • 用T7 Promoter/T7 Terminator通用引物测序，来确定是否含有目的克隆。
• 目的基因表达：
  
  • 感受态细胞： BL21(DE3)表达感受态细胞系列均可用于表达。转化阳性克隆质粒于BL21(DE3)感受态细胞系列进行表达。如果表达毒性基因，建议选择BL21(DE3)pLysS感受态细胞。
    
  • 诱导：挑选单克隆，接种于5mL LB/Amp+培养基中，37℃250rpm培养，当OD600=0.5至0.8时(首选0.6），加入终浓度为0.5～1mM的IPTG诱导表达。为了得到最大量表达，建议试验不同的诱导时间。
    
  • 验证纯化：表达结束后，收集菌体沉淀，经过SDS-PAGE跑胶染色检测蛋白的表达情况，His标签蛋白可用镍柱亲和层析纯化。

• pTOPO-D1载体图谱：
  
  
• pTOPO-D1载体多克隆位点序列：