产品货号：
BTN15-37430
中文名称：
嗜吞噬细胞无浆体(无形体)荧光定量PCR试剂盒(探针法)
英文名称：
Anaplasma phagocytophilum qPCR Kit(Probe Method)
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是以探针法qPCR技术为基础开发的嗜吞噬细胞无浆体的检测试剂盒。
保存：-20℃，有效期2年。
引物-探针干粉在使用前需要离心，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
一、稀释标准曲线样品(以101～106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。本制品不提供活体样品做阳性对照，只提供DNA片段作为阳性对照。
二、样品DNA的制备
三、qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
四、数据处理
相关搜索：嗜吞噬细胞无浆体(无形体)荧光定量PCR试剂盒(探针法)，嗜吞噬细胞无浆体，荧光定量检测，探针法，荧光定量PCR，Anaplasma phagocytophilum qPCR Kit(Probe Method)
嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum)是一种由两层膜包裹的小型革兰氏阴性多形性球菌，直径一般约为0.2～2.0μm，可大至2μm，寄生在真核宿主的细胞质内。嗜吞噬细胞无浆体属于人兽共患病病原，该病原能引起宿主食欲不振、发热、远端肢体水肿、抑郁、不愿移动和瘀点出血等常见的临床症状，亦可引起反刍动物产奶量减少。对于健康状况不佳及免疫抑制者，该病原往往导致严重的并发症甚至死亡，对人和动物均有较强致病性，被认为是一种具有重要公共卫生学意义的新兴病原体。因此嗜吞噬细胞无浆体的快速检测具有重要意义。
- 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
- 引物和探针经过优化，灵敏度高，最低检测限可达100拷贝/反应。
- 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
- 特异性高，引物是根据嗜吞噬细胞无浆体基因组DNA高度保守区设计，不会跟其它生物的DNA发生交叉反应。
- 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时，线性范围至少5个数量级。
- 本制品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
- 本制品只能用于科研。
| 组分 | 规格 |
| 2×Probe qPCR MasterMix | 500μL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 超纯水 | 1mL |
| 嗜吞噬细胞无浆体qPCR引物-探针干粉 | 50次 |
| 嗜吞噬细胞无浆体阳性对照(107拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，有效期2年。
引物-探针干粉在使用前需要离心，然后在离心管中加入165μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。
一、稀释标准曲线样品(以101～106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。本制品不提供活体样品做阳性对照，只提供DNA片段作为阳性对照。
- 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
- 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头(下同)。
- 在6号管中加入5μL 107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡混匀1
分钟，得到106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 - 换枪头，在5号管中加入5μL 106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡混匀1分钟，得到105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在4号管中加入5μL 105拷贝/μL的阳性对照(上步所得)，充分震荡混匀1分钟，得到104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 依次重复上面的操作得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
- 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
- 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
- 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
- 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)
成分 样品管
N+2个PCR阴性
对照管标曲样品管
(1-6)2×Probe qPCR MasterMix 各10μL 10μL 各10μL 嗜吞噬细胞无浆体qPCR引物-探针混合液 各3μL 3μL 各3μL 待测样本DNA模板 7μL 不加 不加 超纯水 不加 7μL 不加 第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号) 不加 不加 各7μL - 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR
过程 温度 时间 预变性 95℃ 5min PCR反应
(40个循环)95℃ 15sec 60℃ 1min
(采集FAM通道，淬灭基团为TAMRA)
四、数据处理
- 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
- 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。
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