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本制品是一种采用荧光基团标记的重组磷酸根结合蛋白，从而可以超高灵敏度检测溶液中的无机磷酸根或ATPase、GTPase，磷酸酶和磷酸二酯酶等酶活性的荧光检测试剂盒。本制品在检测过程中操作简单，使用方便，通常10～30个样品可以在30～60分钟内测定完毕。

本制品对于无机磷酸根(PO₄^3-)的检测灵敏度可以低至100nM。不仅适用于直接检测无机磷酸根的浓度，也被广泛用于检测能够直接或间接催化产生无机磷酸根的ATPase，GTPase，phosphatase和phosphodiesterase等酶的活性。

本制品检测无机磷酸根的敏感范围约在100nM～5μM之间(图2)，比传统的孔雀绿磷酸根检测法(Malachite green phosphate assay)敏感约100倍以上。

无机磷酸根浓度的超灵敏度荧光检测，ATP酶(ATPase)、GTP酶(GTPase)、磷酸酶(Phosphatase)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase)等可以直接或间接催化产生无机磷酸根的酶的高灵敏度活性检测。

组分	200T	1000T
Phosphate Sensor (100μM)	200μL	1mL
10×检测缓冲液	2mL	10mL
Phosphate Standard (10mM)	200μL	1mL

保存：-20℃，避光，有效期1年。

Phosphate Sensor是大肠杆菌(E.coli)磷酸根结合蛋白A197C突变体重组蛋白用环境敏感型荧光基团MDCC进行化学标记的产物。该无机磷酸根荧光探针(phosphate fluorescent probe)对无机磷酸根高度敏感，能和无机磷酸根快速并紧密(Kd~0.1μM)结合。无机磷酸根的结合会引起该传感器蛋白发生明显的构象变化，并导致荧光强度的明显增强。因此该荧光探针可以用于快速、超高灵敏度对溶液中的无机磷酸根进行实时动力学检测。

Phosphate Sensor与无机磷酸根结合后荧光信号显著增强。激发光波长为430nm，发射光波长为450nm的条件下，Phosphate Sensor与无机磷酸根结合后荧光信号增强最为显著，荧光信号升高约9倍(图1)。

图1.本试剂盒中Phosphate Sensor结合无机磷酸根前后的荧光信号差异。检测体系(20μL):5μM Phosphate Sensor,0或1mM Phosphate Standard，1×检测缓冲液。依次将10μL 0或2mM Phosphate Standard和10μL 10μM Phosphate Sensor加入384孔黑板(具体浓度的Phosphate Standard和Phosphate Sensor均由本试剂盒提供的试剂经1×检测缓冲液稀释获得)。采用荧光酶标仪在25℃ 430nm激发光条件下进行不同发射光波长的荧光测定，每组实验体系重复三次并取平均值。当反应体系中不加入无机磷酸根时，Phosphate Sensor在430nm激发光条件下的最大发射波长约为474nm；当反应体系中加入无机磷酸根时，Phosphate Sensor在430nm激发光条件下的最大发射波长约为465nm (图1A)。当激发光/发射光分别为430nm/450nm时，Phosphate Sensor在无机磷酸根结合前后的荧光信号差异最显著(图1B)。


Phosphate Sensor对溶液中浓度低至100nM的无机磷酸根的结合即可导致明显的荧光增强，实测的EC50约为1.7μM (图2)，不同检测条件的检测数据会略有差异。

图2.本试剂盒中Phosphate Sensor结合无机磷酸根的标准曲线。检测体系(20μL):5μM Phosphate Sensor，1×检测缓冲液，0～1mM Phosphate Standard。依次将10μL 0～2mM Phosphate Standard和10μL 10μM Phosphate Sensor加入384孔黑板(具体浓度的Phosphate Standard和Phosphate Sensor均由本试剂盒提供的试剂经1×检测缓冲液稀释获得)。采用荧光酶标仪在25℃激发光/发射光波长分别为430nm/450nm条件下进行荧光测定，每组实验体系重复三次。利用GraphPad Prism软件中的“variable slope”模型[Y=Bottom+Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))]拟合出标准曲线。不同实验条件的检测数据会略有差异，图中数据仅供参考。

• 由于Phosphate Sensor储存液中含有高浓度甘油，为减小操作误差，建议根据每次实验所需的量预先用1×检测缓冲液将一定量的Phosphate Sensor稀释成10μM或其它合适浓度备用。
  
• 请注意不同批次Phosphate Sensor浓度可能会有不同，使用时以收到产品的说明书和产品标签上的浓度为准。
  
• 使用荧光酶标仪检测时，为避免相邻孔之间的荧光信号干扰，推荐使用孔和孔之间不透光的384孔黑板。
  
• 某些表面有涂层的多孔板可能含有无机磷酸根，容易干扰检测体系。因此，建议使用表面未加涂层的384孔黑板进行检测。
  
• 由于不同荧光检测设备的灵敏度有所差异，实际检测过程中可以根据荧光信号的强弱适当调整检测体系中Phosphate Sensor的终浓度。
  
• 检测体系中须注意避免引入气泡，可以在检测之前对检测板进行离心或震荡处理。

• 样品中无机磷酸根浓度的精确测定：
  
  • 试剂的准备：
    根据样品和标准品的数量，溶解10×检测缓冲液，用水配制适量的1×检测缓冲液。按照每个样品或标准品需要5μL 10μM Phosphate Sensor量，用1×检测缓冲液配制适量的10μM Phosphate Sensor。1×检测缓冲液配制后可以冻存并用于后续使用，10μM Phosphate Sensor配制后宜4℃或冰浴保存，并在当日使用，不宜冻存并用于后续使用。Phosphate Sensor的最佳浓度可根据实际检测效果进行适当调整。
    
  • 标准品的准备：
    取适量Phosphate Standard (10mM)，用1×检测缓冲液稀释成不同浓度的标准品，例如2mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、62.5μM、31.3μM、15.6μM、7.8μM……3.9μM、1.95μM、0μM。标准品的浓度范围和浓度点可以根据实际检测效果适当调整。
    
  • 样品的准备：
    对于待检测的样品，根据预测的样品中的无机磷酸根的浓度，用1×检测缓冲液将样品稀释至无机磷酸根的浓度约在200nM～2μM范围，每个样品的体积不少于10μL。
    
  • 标准品和样品的检测：
    
    • 参考下表设置反应体系。使用384孔黑板，先加入10μL 10μM Phosphate Sensor，再加入10μL不同浓度的上述Phosphate Standard溶液或待检测的样品，充分混匀后进行荧光测定。检测条件为25℃，激发光/发射光=430nm/450nm。为减小误差，每组实验体系最好能重复三次。
      

      成分	标准品	样品
      Phosphate Sensor(10μM)	10μL	10μL
      Phosphate Standard	10μL	0μL
      待测样品	0μL	10μL
      总体积	20μL	20μL

    • 利用GraphPad Prism软件中的“variable slope”模型[Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))]拟合出标准曲线，拟合之前需先将Phosphate浓度“X”转换成“log(X)”。根据标准曲线计算出样品中的无机磷酸根的浓度。
• 样品中催化生成无机磷酸根的酶活性检测：
  
  • 终点法酶活性检测：
    
    • 参考文献资料，针对具体的酶，例如ATPase，GTPase，Phosphatase和phosphodiesterase等设置相应的酶反应体系。
      
    • 反应结束后，参考上述步骤A.3，用1×检测缓冲液稀释样品至无机磷酸根浓度约在200nM～2μM范围，每个样品的体积不少于10μL。
      
    • 同上述步骤A，设置标准曲线，并进行标准品和样品的检测。
      
    • 根据样品和对照中检测出的无机磷酸根的浓度，和相应的酶活性定义，计算出样品中的酶活性。如果有必要可以检测样品的蛋白浓度，以计算出单位蛋白含量样品中的酶活性。
  • 酶活性的动力学检测：
    
    • 参考文献资料，针对具体的酶，例如ATPase，GTPase，Phosphatase和phosphodiesterase等规划相应的酶反应体系。推荐反应体系的最终体积为20μL，并在384孔黑板中进行反应。
      
    • 在酶反应体系中加入Phosphate Sensor至终浓度为5μM。
      
    • 加入ATPase等酶的关键底物起始酶反应。
      
    • 每间隔适当时间进行荧光检测，激发光/发射光=430nm/450nm。
      
    • 根据样品和对照在不同时间点的荧光读数，以及参考步骤A进行的标准曲线检测结果，计算出在单位时间内样品中酶催化产生的无机磷酸根的量。然后再根据酶的活性定义，计算出样品中酶活性。如果有必要可以检测样品的蛋白浓度，以计算出单位蛋白含量样品中的酶活性。

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