产品货号：
YTB3118
中文名称：
3D细胞一氧化氮检测试剂盒
英文名称：
By3D Nitric Oxide Assay Kit with DAF-FM DA
产品规格：
200T|1000T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种以DAF-FM DA为荧光探针，快速、便捷、高灵敏地检测3D培养的细胞球或类器官内一氧化氮含量变化的试剂盒。仅需染色20分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞球或类器官内一氧化氮绿色荧光染色。本试剂盒可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪等荧光检测设备进行检测。
本试剂盒提供了诱导细胞产生一氧化氮的阳性对照试剂By3D NOup。本试剂盒提供的By3D NOup为1000×的储存液，推荐终浓度为0.5～2×，最优先的推荐终浓度为1×。同时，本试剂盒提供了By3D DAF-FM DA Assay Buffer，使用更便捷。
- 适用范围广：本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrix-Gel基质胶或Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
- 使用便捷：整个检测过程仅需约20分钟即可完成。3D细胞球经一氧化氮阳性对照试剂By3D NOup等诱导处理后，将本试剂盒中的By3D DAF-FM DA (1000×)按照相应比例用By3D DAF-FM DA Assay Buffer配制成By3D DAF-FM DA检测工作液，避光孵育20分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。
一氧化氮是一种无机氮氧化合物，作为一种反应性自由基，因其分子量小且具有亲脂性，可快速扩散通过生物膜，可作为信号分子将一个细胞产生的信号传递给周围的细胞，具有舒张血管、调节免疫、抑制炎症反应、参与调节神经元兴奋性和神经递质的释放、DNA的修复和保护等功能，在神经系统、免疫系统、心血管系统、细胞凋亡等重要生理过程中发挥着不可或缺的作用。
DAF-FM DA是新一代用于一氧化氮定量检测的荧光探针，比以前比较常用的一氧化氮荧光检测探针DAF-2 diacetate有多方面的改进。首先，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，最后和一氧化氮反应形成的荧光产物受pH值的影响小，在pH值大于5.5时不受pH值的影响。其次，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者产生的荧光更加稳定，不容易淬灭，这样更加便于检测。另外，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者对一氧化氮的检测灵敏度更高，相同条件下检测灵敏度可以提高接近2倍，最低检测浓度可以达到3nM。
DAF-FM DA可以穿过细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身仅有很弱的荧光，但在和一氧化氮反应后可以产生强烈荧光，激发波长为495nm，发射波长为515nm。任何可以检测Fluorescein绿色荧光的仪器，包括荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计或荧光酶标仪都可以用于本荧光探针的检测。
图1．本试剂盒检测3D培养的HCT-116 (人结肠癌细胞)一氧化氮的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板中培养72小时，1×By3D NOup诱导细胞球30分钟，然后吸除培养液后直接加入1×的By3D DAF-FM DA检测工作液，染色20分钟。结果显示，本试剂盒对于By3D NOup诱导后的3D细胞染色效果清晰、明亮，By3D DAF-FM DA染色的对照组细胞无明显阳性染色(B、F)，Hoechst 33342染色的细胞核总体基本一致(C、G)。3D细胞Hoechst 33342染色液需自备。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
| 组分 | 200T | 1000T |
| By3D DAF-FM DA (1000×) | 20μL | 100μL |
| By3D DAF-FM DA Assay Buffer | 20mL | 100mL |
| By3D NOup(1000×) | 20μL | 50μL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
按照96孔板每孔需要100μL By3D DAF-FM DA检测工作液，本试剂盒两个规格分别可以进行200个和1000个样品的检测。
- By3D DAF-FM DA(1000×)和By3D NOup(1000×)第一次使用时请分装成小包装后-20℃保存，避免反复冻融。
- 荧光探针应随用随配。配制好的By3D DAF-FM DA检测工作液应立即使用，不能以后再用。
- By3D DAF-FM DA(1000×)在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
- BSA和酚红对By3D DAF-FM DA的检测有干扰，需避免。
- 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 不同种类的细胞球对诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经By3D NOup诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。
- 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
- 本试剂盒仅限于进行存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。
- By3D DAF-FM DA Assay Buffer经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能影响染色效果。如果By3D DAF-FM DA Assay Buffer发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。
- 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用超低吸附黑色透明底96孔板。
- 3D细胞的准备：
在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒(96孔板)包被的U形底96孔板，或直接使用超低吸附96孔板、超低吸附黑色透明底96孔板等。- 为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预和染色效果较好。
- By3D DAF-FM DA检测工作液的配制：
- By3D DAF-FM DA检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D DAF-FM DA检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- By3D DAF-FM DA检测工作液的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL By3D DAF-FM DA检测工作液的量，用By3D DAF-FM DA Assay Buffer稀释配制适量的By3D DAF-FM DA检测工作液。
样品数量 10个样品 50个样品 100个样品 By3D DAF-FM DA (1000×) 1μL 5μL 10μL By3D DAF-FM DA Assay Buffer 1mL 5mL 10mL By3D DAF-FM DA检测工作液 ~1mL ~5mL ~10mL - 配制By3D DAF-FM DA染色工作液时注意避光，且须现配现用。配制好的工作液须一次使用完毕，不宜保存后使用。
- By3D DAF-FM DA染色工作液中By3D DAF-FM DA的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。By3D DAF-FM DA的推荐工作浓度为1×，可以在0.2～2×范围内摸索最佳工作浓度。
- By3D DAF-FM DA检测工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔By3D DAF-FM DA检测工作液的用量分别为0.5～1mL、200～500μL、100～200μL和50～100μL。
- 阳性对照的设置：
把试剂盒中提供的By3D NOup (1000×)推荐按照1:1000的比例加入到无血清细胞培养液中，处理细胞30分钟。随后按照下面步骤加入By3D DAF-FM DA检测工作液，进行一氧化氮的检测。对于大多数细胞，通常By3D NOup (1×)处理30分钟后一氧化氮含量会大量增加，By3D DAF-FM DA染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经By3D DAF-FM DA染色后应几乎无荧光或显示微弱的绿色荧光。对于特定的细胞，By3D NOup作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度。也可以使用其它验证过的化合物或处理方法作为阳性对照。- 仅在阳性对照孔中加入By3D NOup作为阳性对照，其余孔不必加入By3D NOup。
- By3D NOup实测对于3D培养的HCT-116等细胞球有良好效果，但可能对某些细胞效果微弱或者完全没有效果。
- By3D DAF-FM DA探针的装载：
为达到最佳的检测效果，探针装载和药物处理的先后顺序可以根据细胞和诱导剂的种类、诱导时间长短等实验条件进行摸索和调整。对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载By3D DAF-FM DA探针，后用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载By3D DAF-FM DA探针。但对于3D培养的HCT-116细胞，先用By3D NOup诱导30分钟，再装载探针的效果较好。- 一氧化氮阳性对照(By3D NOup)推荐使用无血清细胞培养液进行稀释，以确保获得良好的诱导效果。对于目的药物，也可以酌情使用无血清细胞培养液进行稀释，以获得良好的诱导效果。
- 去除细胞培养液，加入适量步骤2中配制好的By3D DAF-FM DA检测工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。
- 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。孵育时间可以在15～60分钟内适当调整，不同的细胞最佳孵育时间不同。可以以20分钟作为初始孵育时间，对孵育时间进行适当优化以得到最佳的效果。
- 为达到最佳的探针装载效果，具体孵育时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 检测：
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光酶标仪检测：孵育结束后，小心吸除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测(DAF-FM DA为绿色荧光，Ex/Em=495/515nm，DAF-FM和一氧化氮反应产物的荧光光谱和Fluorescein非常相似，可以用检测Fluorescein的参数设置进行检测，用检测FITC的参数设置进行检测也可以)。通过对比对照组荧光探针的RFU，可以计算出细胞球内一氧化氮的相对比例关系。
- 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
- 荧光显微镜检测：孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
- 其它说明：上述推荐的By3D DAF-FM DA的工作浓度为1000×，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～5000的比例稀释By3D DAF-FM DA，使装载探针时By3D DAF-FM DA的浓度为0.2～0.5×。相反，如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可以把By3D DAF-FM DA的工作浓度为调整为2×，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。
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